WATERS液相色谱教程三四七(最全)
Waters高效液相色谱系统操作规程
Waters高效液相色谱系统操作规程1. 目的规范Waters高效液相色谱系统的使用和维护。
2. 范围本规程适用于Waters高效液相色谱系统的使用和维护。
3. 职责质检室仪器分析员负责Waters高效液相色谱系统的日常使用和维护。
4. 系统组成本系统由Waters 600E多溶剂输送系统（有梯度控制器的高压输液泵）、Waters在线脱气机、Rheodyne 7725i 手动进样阀、Waters 2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成，另外还包括打印机、断电保护器和通风柜等辅助设备。
5. 程序5.1. 准备5.1.1. 使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用0.45μm滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。
5.1.2. 通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
5.2. 开机和泵操作5.2.1. 开机5.2.1.1. 接通断电保护器的电源，依次打开断电保护器、脱气机、600E泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。
5.2.1.2. 打开Millennium32软件，按「Login...」，输入用户名和密码，按「OK」注册进入系统主界面。
在Project档内选择所需的项目，右击『Run Samples』图标，选择色谱系统“600_2487”后打开QuickSet窗口。
5.2.2. 更换溶剂5.2.2.1. 打开600E泵后，转动进口集合管阀手柄（以下简称手柄）至RUN位置；5.2.2.2. 将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂，向右打开参照阀（断开柱和进样器）；5.2.2.3. 按［Direct］键使其显示直接控制屏幕，设流速为1ml/min（梯度配比阀在0ml/min时不工作）；5.2.2.4. 选择欲使用的某一溶剂通道，设其比例为100%，其它为0%；5.2.2.5. 将输液管从原有溶剂瓶中取出，放入一干净的空瓶中；5.2.2.6. 逆时钟转动手柄至DRAW位置，用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂；5.2.2.7. 再将输液管放入新溶剂瓶内，继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止；5.2.2.8. 转动手柄至RUN位置，将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。
waters高效液相色谱
Waters高效液相色谱操作说明一．简介本高效液相色谱实验包括：waters1525泵+waters2487双波长检测器+色谱柱+电脑（breeze 图谱处理软件）+流动相二．操作流程0.准备工作确定色谱实验方法，处理好流动相1，换好流动相，确定色谱柱选择无误1.开机打开泵开关，听到两声“嘀”的响声之后，再打开波长检测器。
检测器进入预热阶段（此时检测器面板进入5min倒计时）这期间打开电脑，进入英文windows操作系统2，待检测器自检完毕（整个自检过程约6~7min），打开电脑桌面的（Breeze软件）。
待程序完全启动，整个开机过程结束。
系统默认进入上次使用的方案。
2.建立新方法和新方案2.1新建方案方案主要用来储存你的各个实验方法，数据等内容，你可以把它理解为一个文件夹。
2.1.1创建步骤选择→单击→单击"next"→在"project name"中输入方案名称（如abc），"comments"中可填注释，也可不填。
→单击"finish"2.1.2打开创建的方案在界面下→单击→在"project"中找到你创建的方案（如abc）→点击"OK",即进入到我们自己的方案中了2.2新建方法在新建的方案中，需要建立不同的试验方法。
试验方法主要设定的包括洗脱方式，检测波长等参数。
2.2.1新建方法步骤单击→单击→单击（Flow选项卡）→在programmed flow中设定你的洗脱方式（此步在2.2.2详述）→单击→单击（channel 1选项卡）→在"wavelength"框内设定你的检测波长（如265nm,280nm,215nm等等）→（设定结束，保存）：单击→输入方法名称如（abc 1）→单击"save"32.2.2洗脱方式的设定（重要）在programmed flow中可看到。
(完整word版)Waters Xevo TQS液相色谱质谱操作
Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)操作指南1.适用范围：本使用规范适用于有机室所备有的Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)。
2.仪器设备的主要技术指标：1) 梯度性能：保留时间标准偏差（SD）≤0.047min。
2) ESI正离子灵敏度和精密度：测试样品：磺胺二甲基哒嗪(Sulfadimethoxine)，浓度：0.1pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥3000:1；平均峰面积≥60000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:4500psi；峰面积：120000；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.5%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
3) ESI负离子灵敏度和精密度：测试样品：氯霉素(chloramphenicol)，浓度：0.05pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥400:1；平均峰面积≥1000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:520psi；峰面积：1500；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.8%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
4) 系统精密度（TUV/PDA）：峰面积相对标准偏差（%RSD）≤0.5%；峰高相对标准偏差（%RSD）≤0.9%。
5) NanoFlow正离子灵敏度指标要求：峰强（m/z =785.8）≥1×107，测试样品：Glu-Fibrinopeptide B，浓度：100fmol/μl测试结果：峰强度（m/z =785.8）：1.48×107；符合指标要求。
6) T RIZAIC正离子模式MS说明：测试样品：ADH T19, PHO T33, ENL T4, BSA T59, ENL T43, ADH T17, BSAT10, PHO T88指标要求：保留时间标准偏差：≤0.25%测试结果：ADH T19：标准偏差为0.02% (23.77min)；PHO T33：标准偏差为0.03% (25.12min)；ENL T4：标准偏差为0.02% (21.83min)；BSA T59：标准偏差为0.01% (21.58min)；ENL T43：标准偏差为0.04% (22.33min)；ADH T17：标准偏差为0.03% (23.31min)；BSA T10：标准偏差为0.02% (24.41min)；PHO T88：标准偏差为0.03% (24.81min)7) 系统性能测试一维系统精密度测试：测试样品17α-OHP。
Waters高效液相色谱Empower 工作站中文教程
WatersHPLC System Basic Teaching Material For Empower Software沃特斯高效能液相層析系統－資料處理軟體基礎操作指引美商沃特斯公司-台灣分公司Version Issue Date Author Comments1.0 Aug / 2003 Waters Taiwan Initial VersionContent一、電腦/層析軟體開機/開始操作畫面說明 (3)二、資料處理系統操作介面/畫面說明 (3)三、Project 之建立 (4)四、層析系統(Chromatographic system)之建立 (8)五、使用者(User)之建立 (11)六、實驗開始/ 儀器方法( Instrument Method )之建立 (13)七、數據處理方法( Processing Method )之建立 (16)八、報表列印說明 (24)一、電腦/層析軟體開機/開始操作畫面說明a.打開電腦電源開關，進入作業系統，連續按兩下”EMPOWER LOGING” 圖像。
b.輸入UserName(例如:System)、Password(例如:Manager)，按OK。
c.進入EMPOWER畫面( Pro 或Quick Start介面，可依使用者設定而不同)。
二、資料處理系統操作介面/畫面說明圖像功能描述Run Samples 開始樣品分析。
Browse Project Project 瀏覽、數據處理與列印。
Configure System 層析系統設定。
Process Data 數據處理。
Review Data 數據瀏覽、處理。
Print Data 報表列印。
三、PROJECT 之建立a.打開電腦電源開關，進入作業系統，連續按兩下”EMPOWER LOGING” 圖像。
b.輸入UserName以及Password，按OK。
c.進入EMPOWER Pro畫面，點選”Configure System”。
waters液相色谱仪操作规程
液相色谱仪操作规程仪器名称：液相色谱仪Waters2695型（带光电二极管阵列PDA 2998、蒸发光散射ELS 2424检测器）光电二极管阵列一般可用5mg/L来试条件。
第一步：准备工作（1）把水和有机相分别加入各瓶中。
(纯水一周一换，换溶剂时需小心，不要用手触摸管道)。
有机相必须为进口色谱级纯度。
（2）开机顺序：电脑→泵→检测器→工作站1）泵的开启，在2695主机界面上直接操作。
待仪器自检完毕，显示Idle后，选择Menu status进行各项操作：a.仪器长久不用，管路干了，应使用Dry prime功能。
b.每次开机，都要用Wet prime功能，将要用的各个通道冲洗一遍（A为甲醇，C为乙腈，D为纯水），排除气泡。
此过程流动相不通过柱子。
具体操作为：用方向键选择一个通道，比例调成100%，其余通道为0%，在direct function 中选择wet prime，按默认值进行。
冲洗完成后，进行下一个通道的冲洗，直到完成。
仪器使用过程中，如果哪个通道更换或增加了溶剂，都要用Wet prime将此通道冲洗一遍。
c.温度设置：直接将柱温设置成所需温度，一般为30℃。
d.Purge injection：在direct function中选择Purge injection，按默认值进行。
e.Equilibrium：将流量从0调至1mL/min，如果长久不用，不能直接调，而应逐渐将流速调至1mL/min。
将通道比例调成所需比例，注意此过程流动相通过柱子，所以切记不能出现纯水通道100%的情况，纯水比例最大为95%。
在direct function中选择Equilibrium，按默认值进行。
注意：每一步操作都应在仪器显示Idle状态后再进行。
2）检测器的开启绿灯状态为自检；灯为黄色、不闪并听见提示音，为启动完成。
3）工作站的开启Empower登陆：用户名为system，密码为manager窗口左边选择项目，窗口右边选择系统（检测器）。
Waters高效液相色谱系统操作规程
Waters高效液相色谱系统操作规程一. 准备1. 使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制）。
2. 通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
3. 接通电源，依次打开1525泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。
4. 打开Breeze软件，进入系统主界面。
二. 操作步骤1.更换流动相。
2.在主界面中点击“Manage Breeze”按钮，选择system选项，出现系统连接示意图，观察各个部件是否连接好。
若未连接好，则需点击“Diagnostics/Reconfigure”进行诊断。
3.回到主界面，选择“Manage Breeze”中的project选项，单击“Make a new project”，“Next”，在“Project Name”中输入名称，单击“Finish”。
单击“Change a project/User”，在“Project”中选择输入的名称，单击“OK”。
4.单击“View Method”按钮，点击“Pump”图标，设置泵的参数。
点击“UV Det”图标，设置紫外检测器的波长。
单击“Save Method”按钮保存设置方法。
5. 打开泵的抽液阀，使用灌注注射器抽取一定量的洗脱剂。
单击Purge图标，出现“Purge Wizard”对话框，选中“Purge Pump”选项，点击“Next”“Next”，调节A、B泵的流量分别为约3ml/min。
打开泵的参考阀，点击“Next”。
Purge结束后关闭参考阀。
6.点击主界面中的“press to equilibrate system/ monitor baseline”按钮，平衡系统0.5－1h，直至基线稳定。
7.点击“press to make a single injection”按钮，进入“Specify Single Inject Parameters”对话框，设置参数，点击“inject”。
WATERS液相色谱教程三四七(最全)
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反压与流速的关系
流速对反压的影响是线性关系 流速增加，反压亦增大 下图的实验条件： –2.1×30mm Symmetry C18柱,20℃
Pressure vs. Flow Rate at 20?C 5000 4500 4000 3500 3000
有机滤膜(≤0.5 µ m)/水溶性滤膜(≤0.45 µ m) 膜片可更换
– 一次性使用的膜“Cartridge”
使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理
高速离心
大于：10,000rpm
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超滤
机理
– 超滤是一种基于分子量分离的技术
排气后的色谱泵即可用于实验运行
– 注意∶
排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱 如需要，恢复排气时断开的控制线
根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值
若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡 (包括排气操作)
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样品预处理常用的方法
高速离心取上清液 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-液萃取 固相提取(Solid Phase Extract,SPE )
– Oasis和Sep-Pak固相提取小柱
其它
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去除微粒的方法
过滤
– 过滤膜/过滤装置
Pressure vs. Temperature 5000 4500 4000 3500 3000
50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
Waters Xevo TQS液相色谱质谱操作
Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)操作指南1.适用范围：本使用规范适用于有机室所备有的Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)。
2.仪器设备的主要技术指标：1) 梯度性能：保留时间标准偏差（SD）≤0.047min。
2) ESI正离子灵敏度和精密度：测试样品：磺胺二甲基哒嗪(Sulfadimethoxine)，浓度：0.1pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥3000:1；平均峰面积≥60000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:4500psi；峰面积：；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.5%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
3) ESI负离子灵敏度和精密度：测试样品：氯霉素(chloramphenicol)，浓度：0.05pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥400:1；平均峰面积≥1000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:520psi；峰面积：1500；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.8%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
4) 系统精密度（TUV/PDA）：峰面积相对标准偏差（%RSD）≤0.5%；峰高相对标准偏差（%RSD）≤0.9%。
5) NanoFlow正离子灵敏度指标要求：峰强（m/z =785.8）≥1×107，测试样品：Glu-Fibrinopeptide B，浓度：100fmol/μl测试结果：峰强度（m/z =785.8）：1.48×107；符合指标要求。
6) T RIZAIC正离子模式MS说明：测试样品：ADH T19, PHO T33, ENL T4, BSA T59, ENL T43, ADH T17, BSA T10, PHO T88指标要求：保留时间标准偏差：≤0.25%测试结果：ADH T19：标准偏差为0.02% (23.77min)；PHO T33：标准偏差为0.03% (25.12min)；ENL T4：标准偏差为0.02% (21.83min)；BSA T59：标准偏差为0.01% (21.58min)；ENL T43：标准偏差为0.04% (22.33min)；ADH T17：标准偏差为0.03% (23.31min)；BSA T10：标准偏差为0.02% (24.41min)；PHO T88：标准偏差为0.03% (24.81min)7) 系统性能测试一维系统精密度测试：测试样品17α-OHP。
Waters液相色谱教程4
紫外-可见光检测器原理基于样品池(S)中的样品对光产生吸收,与参比池(R)有信 号差如是可变波长检测器,还有分光系统(光栅) 流动池灯R S样品入口光电二极管2004 Waters CorporationBeer's Law – 比尔定律光能量: – P0 = 透过溶剂的光能量 – P = 透过样品的光能量光通量(透过率%):T=P/P0A吸光度: A = -log(T)= log(P0/P)B吸光度 = 单位吸光度×流动池长度×溶液浓度 – 即: A = abc** * * ** * *透过率 %吸光度 AU ** 浓度浓度2004 Waters Corporation影响紫外检测器灵敏度的因素信号强度(S) – 从比尔定律可看出 1AU 样品的种类 样品浓度及进样的体积 检测池的长度 – 所使用的波长,检测器的 时间常数噪音 10% 1%.25AU噪音(N) – 流动相 – 所使用的波长,灯的能量 – 检测器的时间常数 – 非检测器因素 电噪音,泵脉动等S/N = 1/0.1=10 S/N = 0.25/0.01 = 252004 Waters Corporation示差折光效应的影响示差折光效应的危害 – 产生假的紫外吸收变化: 定量误差,光谱图不准确 梯度时严重的基线漂移梯形狭缝设计 – 用于2487的最新专利设计 – 消除示差折光效应影响的同时,提高灵 敏度及线性范围梯形池设计 – 最初的专利设计这是示差折 光效应的一个例 子,光从一个介 质到另一个介质 发生折射现象2004 Waters Corporation溶剂对紫外检测器的影响乙 腈 190nm不同种类溶剂有其特定的 止波长溶剂的质量好坏对其截止 长有影响为何溶剂质量不好? – 含紫外吸收的杂质 – 溶解在其中的氧气 – 缓冲液溶质的紫外吸收截止波长 – 又称溶剂吸收波长的上限甲 醇 210nm200 220 240 260或溶剂透过波长的下限2004 Waters Corporation流动相背景吸收的影响理想状态背景吸收会减 小线性范围21实际情形Absorbance1许多溶剂产生 背景吸收0背景吸收0Concentration2004 Waters CorporationWaters 2487 检测器2004 Waters Corporation2487检测器的特点专利的梯形狭缝池设计 –消除示差折光效应的影响其它特点– – – – – –波长范围: 190 - 700 nm 光源: 氘弧灯 双通道,高灵敏度,检测范围:±2AU 仪器内集成比色皿位置,可做光谱扫描 灯开/关定时器: 时间编程 多种功能,胜任更复杂的工作 MaxPlot,RatioPlot,灯优化软件等 注: AU(Absorbance Unit) 吸光度单位2004 Waters Corporation2487检测器的光路filter wheellamp housing window slitspherical mirrorbeam splittergratingcuvettesample diode flow cell photo diodes reference diode2004 Waters Corporation梯形狭缝流动池的比较进口 出口圆柱形池进口 出口梯形池进口 出口梯形狭缝池2004 Waters Corporation光电二极管矩阵检测器原理Shutter Holographic Grating CellD2 LampDiode Array 512 Diodes 190 - 800 nm2004 Waters CorporationPDA检测器的三维(3D)图2AUY1AU吸光度0190波长Z450051015X时间2004 Waters Corporation几种不同的分辨率定义二极管分辨率: 每个二极管的分辨率 – 检测器的波长范围是190 到 800nm 而二极管矩阵中有 512个二极管.因此, 610nm除以512 大约等于 1.2 nm/ 每个二极管光学分辨率: – 狭缝宽度决定光学分辨率,2996的光学分辨率是1.2nm– 光学分辨率影响光谱分辨率光谱分辨率: – 光谱分辨率是指在采集光谱数据时数据点之间的波长间 隔(nm), 2996的光谱分辨率最高是1.2 nm.2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率高分辨率的光学单元应 是:一束光照在一 个 光电二极管上 光学分辨率及数字分辨 率相同 但是带来的问题是:1nm 的二极管及1nm分辨率–光 通 量 下 降 导 致 噪 音光电二极管 加大 –光 学 分 辨 率 和 噪 音 是 一对矛盾狭缝2004 Waters Corporation光学分辨率及数字分辨率加大光通量– 增加狭缝宽度1nm的二极管及3nm的分辨率牺牲分辨率狭缝光电二极管– 通过狭缝的光要照到彼此 相邻的光电二极管上,三 相邻光电二极管的光谱信 息是一样的 – 如左图所示,虽然数字分 率是1nm,实际的光学分 辨率只有 3nm2004 Waters Corporation"苯"的不同分辨率光谱图1.2 nmAbsorbanceAbsorbance2.4 nm230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.003.6 nmAbsorbance4.8 nmAbsorbance230.00250.00nm270.00230.00250.00nm270.002004 Waters CorporationWaters 2996 PDA 检测器PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵2004 Waters Corporation2996 检测器的光路全新的光路设计– 不用聚光镜及各种消 色差镜以减少光路能 量损失 – 反相梯形光束流动池 用以消除示差折光效 应影响同时提高灵敏度及分 辨率– 分辨率:1.2nm – 噪音:±1.5×10-5AU2004 Waters Corporation专利技术:反相梯形光束检测池2004 Waters Corporation2996 检测器的特点兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 – 在收集色谱图的同时,得到光谱图: 三维(3D) 数据 – 亦可采集单波长色谱图: 二维(2D)数据色谱峰的纯度鉴定,色谱峰的确认任意波长的再处理所有的操作皆通过Empower软件控制完成2004 Waters Corporation。
Waters液相色谱教程3
液相色谱检测模式
响应类型
RI 折射率
通用型
UV/VIS FLUOR 紫外/可见 荧光
选择性 选择性
ECD 电化学
选择性
COND ELSD 电导 蒸发光散射
选择性 半通用
灵敏度
µg
ng
pg
pg
pg
ng
线性范围 104
105
103
106
105
103
流速敏感 Yes
– 两个压力传感器感应并 调整柱塞内压力，柱塞 间交换平稳
– 没有出口阀，减少故障 率
©2004 Waters Corporation
2695溶剂输送系统的特点
独立的柱塞杆驱动马达
– 双压力传感器，监视系统及柱塞腔压力 – 软件根据传感器的反馈，控制所有功能 – 完全没有压力的脉动 – 只有两个进口阀，没有出口阀，可靠性极高
的工作
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2695 样品管理系统:特点
全电子设计,除电源外,
不需其它任何动力
极佳的线性范围及进样
重现性
交差污染极小（全自动
进样针内、外清洗装置）
低维护成本
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2695:样品管理系统
样品瓶数目: 120, 分装于5个样品盘(24瓶/盘) 进样次数: 每瓶可进1 到99次 标准样品瓶: 2 mL 样品室温控: 4 到40℃ ,增量 1℃ 进样体积: 标准配置:0.1 到100 uL 定量环选件: 0.1到2000 uL 最小样品量: 10 uL, 用低体积的内插式小瓶 (Insert) 最小进样量: 0.1 uL
Waters Xevo TQS液相色谱质谱操作
Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)操作指南1.适用范围：本使用规范适用于有机室所备有的Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)。
2.仪器设备的主要技术指标：1) 梯度性能：保留时间标准偏差（SD）≤0.047min。
2) ESI正离子灵敏度和精密度：测试样品：磺胺二甲基哒嗪(Sulfadimethoxine)，浓度：0.1pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥3000:1；平均峰面积≥60000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:4500psi；峰面积：；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.5%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
3) ESI负离子灵敏度和精密度：测试样品：氯霉素(chloramphenicol)，浓度：0.05pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥400:1；平均峰面积≥1000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:520psi；峰面积：1500；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.8%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
4) 系统精密度（TUV/PDA）：峰面积相对标准偏差（%RSD）≤0.5%；峰高相对标准偏差（%RSD）≤0.9%。
5) NanoFlow正离子灵敏度指标要求：峰强（m/z =785.8）≥1×107，测试样品：Glu-Fibrinopeptide B，浓度：100fmol/μl测试结果：峰强度（m/z =785.8）：1.48×107；符合指标要求。
6) T RIZAIC正离子模式MS说明：测试样品：ADH T19, PHO T33, ENL T4, BSA T59, ENL T43, ADH T17, BSA T10, PHO T88指标要求：保留时间标准偏差：≤0.25%测试结果：ADH T19：标准偏差为0.02% (23.77min)；PHO T33：标准偏差为0.03% (25.12min)；ENL T4：标准偏差为0.02% (21.83min)；BSA T59：标准偏差为0.01% (21.58min)；ENL T43：标准偏差为0.04% (22.33min)；ADH T17：标准偏差为0.03% (23.31min)；BSA T10：标准偏差为0.02% (24.41min)；PHO T88：标准偏差为0.03% (24.81min)7) 系统性能测试一维系统精密度测试：测试样品17α-OHP。
Waters高效液相色谱仪
海德氨基酸工业有限公司标准操作规程1 目的规范Waters高效液相色谱仪使用操作。
2 适用范围 Waters高效液相色谱仪的使用操作。
3 责任者质管部QC检验人员。
4 内容4.1 系统进入4.1.1 依次开UPS电源、检测器、泵、打印机、电脑主机电源。
4.1.2 电脑进入自检，自检完成后，进入“Program Manager”窗口。
4.1.3 在“Program Manager”窗口，双击“Millennium”图标，进入相应窗口。
4.1.4 在“Millennium”窗口，双击“Session Manager”图标，进入“Millennium V2.10”窗口，进行内存自检。
4.1.5 内存自检完成后，进入“Millennium Login－Version2.10”窗口，在“User Name”输入“system”，在“Password”输入“manager”，按“Login”进入“Millinniam Version2.10－Session Manager－User System”窗口，双击所选“Project”图标，即进入“Project”窗口。
4.2 进样4.2.1 在“Project”窗口下，按“Tools”图标群中“Quickset”图标进入“System-open”窗口，选择“PCM－410”。
4.2.2 按“OK”加以确认，该窗口自动退出，进入自检。
4.2.3 自检完毕，进入“Quick Set”窗口，按“Mode”选择“Quick Start”进入“Method Set”窗口，选择“Using Exiting Method”自动进入“Quick Set Acquisition”窗口，按“Set Up Instrument”，进入仪器安装状态。
4.2.4 安装完毕，按“Cancel”，退出“Quick Set Acquisition”窗口，在样品登药业有限公司标准操作规程题目Waters高效液相色谱仪操作规程编号版本号共 6 页SOP-EM-319A第 2 页记表上填写样品名、类别、进样体积、运行时间。
液相色谱教程WATERS
4 3 2 1 2 3
Conventional C18
T
Modern C18 Ideal
4
5 Buffer pH
6
7
8
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色谱图常见问题分析(二)
色谱图多峰少峰问题: –色谱图中未出峰: 进样问题:未进样或样品分解 流动相问题:泵未输液或流动相不正确 检测器设置不正确,或检测器有问题
色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题: –双峰或肩峰 进样量或样品浓度过大 保护柱或色谱柱进口堵塞 保护柱或色谱柱污染或失效 –前伸峰 进样量或样品浓度过大 溶样的溶剂相对于流动相太强 保护柱或色谱柱污染或失效
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色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题: –平头峰 检测器设置不正确 进样体积太大或样品浓度太高 –拖尾峰 保护柱或色谱柱问题:污染或失效 进样问题 检测器时间常数不正确
色谱图常见问题分析(一)
色谱峰峰形异常问题:
– 所有的峰均为负峰: 信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒 光学装置尚未达到平衡 – 一个或几个峰是负峰 流动相吸收本底高 进样过程中进了空气 离子对分离中的系统峰 样品组分的吸收(RI或UV)低于流动相
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HPLC常见问题分析
• 流路基线噪音问题
–基线漂移 系统不稳或未化学平衡 温度波动 流动相未正确脱气 流动相被污染;流动相中有稳定剂或稳定剂变化 检测器流动池漏;系统中有渗漏 色谱柱污染;固定相渗漏 选用不正确的检测波长(相对于溶剂) 有迟流出的组分
Waters高效液相色谱仪标准操作规程(格式排版)
1.目的描述 Waters 高效液相色谱仪标准操作规程。
2.适用范围化验室3.责任者化验员应严格遵照该操作规程 , QC 主管负责监督本规程的实施。
4.定义HPLC High Performance Liquid Chromatography , 高效液相色谱仪。
5.安全注意事项5.1有机溶媒有害健康，各溶剂瓶口应封严。
5.2检查废液桶中废液应避光，防止废液桶满外溢。
6.规程6.1W a t e r s H P L C的组成：贮液器→输液泵→自动进样器→分离柱(柱温箱)→紫外检测器→控制及数据处理系统(M i l l e n n i u m32化学工作站)。
6.2H P L C系统的打开及关闭顺序6.2.1 打开顺序对于分体式：请按泵、进样器、柱温箱、检测器的顺序打开开关，待各部分分别显示初始化完毕后，最后打开 Millennium 32化学工作站。
泵与色谱工作站的连接：对于 510 泵，因为此泵与色谱工作站是单向联系，如要使泵在 Remote 状态下由工作站控制，首先要在泵的键盘上按 Menu 键，待显示屏切换至 Mode 状态下，其状态是 Loca ，按 Edit/Enter 键，在 Local 的 L 前有闪动的光标显示，按 键，Local 转换成Rem，再按Edit/Enter 键，此命令已输入进去, 最后按Stop/Run 键，使泵处于Run 状态这时泵和工作站的连接即告成功。
泵的任何动作都可由工作站来控制。
还应注意这一步工作在每次开机时都要进行。
对于 Alliance 2690 系统：先打开 Alliance 2690 主机、检测器电源开关，待初始化完毕后，再进入 Millennium 32化学工作站。
对于流动相的要求：对于液体试剂应尽量采用色谱纯试剂；对于所用到的固体试剂应采用分析纯试剂；对于水，应采用经纯水机处理过的超纯水；流动相在使用前一定要经 0.45μm 的滤膜（滤膜分为水相膜与有机相膜，确保使用正确的滤膜，参见附表 ) 过滤、超声真空脱气方可使用，严禁含盐的流动相未经过滤直接使用。
Waters Xevo TQS液相色谱质谱操作
Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)操作指南1.适用范围：本使用规范适用于有机室所备有的Waters Xevo TQ-S液相色谱/质谱联用仪(三重串连四级杆质谱)。
2.仪器设备的主要技术指标：1) 梯度性能：保留时间标准偏差（SD）≤0.047min。
2) ESI正离子灵敏度和精密度：测试样品：磺胺二甲基哒嗪(Sulfadimethoxine)，浓度：0.1pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥3000:1；平均峰面积≥60000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:4500psi；峰面积：120000；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.5%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
3) ESI负离子灵敏度和精密度：测试样品：氯霉素(chloramphenicol)，浓度：0.05pg/μl指标要求：平均信噪比（S/N）≥400:1；平均峰面积≥1000；峰面积相对标准偏差（%RSD）≤3.0%；保留时间标准偏差（SD）≤0.047min测试结果：信噪比（S/N）:520psi；峰面积：1500；峰面积相对标准偏差（%RSD）：2.8%；保留时间标准偏差（SD）：0.00min，均符合指标要求。
4) 系统精密度（TUV/PDA）：峰面积相对标准偏差（%RSD）≤0.5%；峰高相对标准偏差（%RSD）≤0.9%。
5) NanoFlow正离子灵敏度指标要求：峰强（m/z =785.8）≥1×107，测试样品：Glu-Fibrinopeptide B，浓度：100fmol/μl测试结果：峰强度（m/z =785.8）：1.48×107；符合指标要求。
6) T RIZAIC正离子模式MS说明：测试样品：ADH T19, PHO T33, ENL T4, BSA T59, ENL T43, ADH T17, BSAT10, PHO T88指标要求：保留时间标准偏差：≤0.25%测试结果：ADH T19：标准偏差为0.02% (23.77min)；PHO T33：标准偏差为0.03% (25.12min)；ENL T4：标准偏差为0.02% (21.83min)；BSA T59：标准偏差为0.01% (21.58min)；ENL T43：标准偏差为0.04% (22.33min)；ADH T17：标准偏差为0.03% (23.31min)；BSA T10：标准偏差为0.02% (24.41min)；PHO T88：标准偏差为0.03% (24.81min)7) 系统性能测试一维系统精密度测试：测试样品17α-OHP。
WATERS
分離是一個物理過程
洗脫
色譜法的分類
按流動相的物態分
氣相色譜(gas chromatography,GC) 用氣體作為流動相(又叫載氣) 液相色譜(liquid chromatography,LC) 用液體作為流動相(又叫洗脫劑)
色譜法的分類
按分離過程的機理分
吸附色譜 根據樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實現分離 分配色譜 分離基于樣品組分在固定相和流動相中溶解度(分配系數)不同 離子交換色譜 根據樣品組份離子交換親和力的差異分離 體積排除色譜 GPC(Gel Permeation Chromatography) 固定相是疏水性凝膠,流動相是有機溶劑 GFC(Gel Filtration Chromatography) 固定相是親水性凝膠,流動相是水溶劑
流動相的溶劑組成
流動相的黏度是產生反壓的主要原因
溫度 流速
流速對反壓的影響是線性關系
檢測器
檢測器的啟動操作 開啟電源后,需待檢測器通過自檢后,才能被軟件 控制(需5-10分鐘) 通流動相平衡至少需要三十分鐘后才能正常工作
WATERS 2487檢測器
2487檢測器的顯示屏幕
WATERS 2487檢測器
流動相的脫氣的目的
使色譜泵的輸液准確
輸液量均勻准確,并且脈動減小,保留時間及色譜峰面積的重現性提高
提高檢測的性能
防止氣泡引起的尖峰,基線穩定,溶劑的紫外吸收本底降低 保護色譜柱 減少死體積,防止填料的氧化
流動相的脫氣的方法
加熱, 抽真空, 超聲波震蕩, 通惰性氣體, 在線脫氣機
流動相的保存
有機溶劑流動相
標樣濃度C(Xi) 標樣響應值R(Xi)
Waters高效液相色谱系统操作规程
Waters高效液相色谱系统操作规程一. 准备1. 使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用滤膜过滤）、样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制）。
2. 通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
3. 接通电源，依次打开1525泵、2487检测器，待检测器自检结束显示测量状态时，打开打印机、电脑显示器、主机。
4. 打开Breeze软件，进入系统主界面。
二. 操作步骤1.更换流动相。
2.在主界面中点击“Manage Breeze”按钮，选择system选项，出现系统连接示意图，观察各个部件是否连接好。
若未连接好，则需点击“Diagnostics/Reconfigure”进行诊断。
3.回到主界面，选择“Manage Breeze”中的project选项，单击“Make a new project”，“Next”，在“Project Name”中输入名称，单击“Finish”。
单击“Change a project/User”，在“Project”中选择输入的名称，单击“OK”。
4.单击“View Method”按钮，点击“Pump”图标，设置泵的参数。
点击“UV Det”图标，设置紫外检测器的波长。
单击“Save Method”按钮保存设置方法。
5. 打开泵的抽液阀，使用灌注注射器抽取一定量的洗脱剂。
单击Purge图标，出现“Purge Wizard”对话框，选中“Purge Pump”选项，点击“Next”“Next”，调节A、B泵的流量分别为约3ml/min。
打开泵的参考阀，点击“Next”。
Purge结束后关闭参考阀。
6.点击主界面中的“press to equilibrate system/ monitor baseline”按钮，平衡系统0.5－1h，直至基线稳定。
7.点击“press to make a single injection”按钮，进入“Specify Single Inject Parameters”对话框，设置参数，点击“inject”。
(完整)Waters高效液相色谱仪标准操作规程
1.目的描述 Waters 高效液相色谱仪标准操作规程。
2.适用范围化验室3.责任者化验员应严格遵照该操作规程 , QC 主管负责监督本规程的实施。
4.定义HPLC High Performance Liquid Chromatography , 高效液相色谱仪。
5.安全注意事项5.1有机溶媒有害健康，各溶剂瓶口应封严。
5.2注意检查废液桶中废液应避光，防止废液桶满外溢。
6.规程6.1.Waters HPLC的组成：贮液器输液泵自动进样器分离柱 (柱温箱 )紫外检测器控制及数据处理系统 (Millennium 32化学工作站 )。
6.2. HPLC系统的打开及关闭顺序6.2.1打开顺序•对于分体式：请按泵、进样器、柱温箱、检测器的顺序打开开关，待各部分分别显示初始化完毕后，最后打开M i l l e nn i um32化学工作站。
泵与色谱工作站的连接：对于 510 泵，因为此泵与色谱工作站是单向联系，如要使泵在 Remote 状态下由工作站控制，首先要在泵的键盘上按 Menu 键，待显示屏切换至 Mode 状态下，其状态是Loca ，按 Edit/Enter 键，在 Local 的L 前有闪动的光标显示，按键，Local 转换成Rem，再按Edit/Enter 键，此命令已输入进去, 最后按Stop/Run 键，使泵处于Run 状态这时泵和工作站的连接即告成功。
泵的任何动作都可由工作站来控制。
还应注意这一步工作在每次开机时都要进行。
对于 Alliance 2690 系统：先打开 Alliance 2690 主机、检测器电源开关，待初始化完毕后，再进入 Millennium 32化学工作站。
对于流动相的要求：对于液体试剂应尽量采用色谱纯试剂；对于所用到的固体试剂应采用分析纯试剂；对于水，应采用经纯水机处理过的超纯水；流动相在使用前一定要经 0.45m 的滤膜（滤膜分为水相膜与有机相膜，确保使用正确的滤膜，参见附表 ) 过滤、超声真空脱气方可使用，严禁含盐的流动相未经过滤直接使用。
waterse高效液相色谱学习教案
常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃>
甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳 (sì lǜ huà tàn)>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
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第十七页，共42页。
打印机
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2 开机(kāi jī)
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测器、 计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕(píngmù)，此时继续各部件的初始化。
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第十页，共42页。
溶剂(róngjì)管理系统的准备
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液相色谱教程
(三)
液相色谱实验操作
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源
– 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打 开计算机，启动色谱管理软件
准备流动相
– 过滤,脱气
色谱泵排气
– 用新配制的流动相灌注泵
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Pressure vs. Temperature 5000 4500 4000 3500 3000
50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
psi
2500 2000 1500 1000 500 0 10.0 20.0 30.0 40.0 Degrees, C 50.0 60.0 70.0
输液量均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
– 提高检测的性能
防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低
– 保护色谱柱
减少死体积 防止填料的氧化
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流动相脱气的方法
加热 – 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易 造成流动相组成的变化 抽真空 – 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波振荡 – 简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟 左右即可) 通惰性气体（一般用氦气） – 可保持在线连续脱气，多用于低压梯度 – 可保持连续脱气，多用于低压梯度
关于色谱系统的反压
什么是反压(back pressure)
–流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,
又称系统反压或系统压力
–Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋) –其它单位有:Bar,Mpa
影响系统反压的主要因素:
–流动相的溶剂组成 –温度 –流速
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有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
– 低温密封保存 – 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
启动液相色谱仪器的流程
用准备好的流动相平衡色谱系统 – 可在泵的控制面板上设定流速参数(15×5泵需在软件 控制下操作) – 系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作
准备样品 – 用流动相溶样或重组样品
编制仪器方法,开始实验
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液相色谱对流动相的要求
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反压与流速的关系
流速对反压的影响是线性关系 流速增加，反压亦增大 下图的实验条件： –2.1×30mm Symmetry C18柱,20℃
Pressure vs. Flow Rate at 20?C 5000 4500 4000 3500 3000
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实验样品的制备
标样和样品
– 标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参 考标准物,一般是纯度较高的纯物质 – 样品:待测物,一般是成分复杂的混合物
液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:
– 必须能溶于流动相
如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样 时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱
– 样品溶液要过滤除去微粒及杂质 – 了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用
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复杂样品的预处理
样品预处理的目的
– 除去微粒 – 减少干扰杂质 – 浓缩微量的组份 – 提高检测的灵敏度及选择性 – 改善分离的效果 – 有利于保护色谱柱及仪器
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50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
psi
2500 2000 1500 1000 500 0 0.0 0.2 0.4 0.6 mL/min 0.8 1.0 1.2
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反压与温度的关系
温度对反压的影响是反比关系 温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些
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在线脱气机 （in-line degasser)
流动相的保存
有机溶剂流动相:
– 室温下密封,避光保存
缓冲盐流动相:
– 当日现配现用 – 低温下密封保存,一般不超过3天 – 防止微生物生长
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样品预处理常用的方法
高速离心取上清液 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-液萃取 固相提取(Solid Phase Extract,SPE )
– Oasis和Sep-Pak固相提取小柱
其它
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去除微粒的方法
过滤
– 过滤膜/过滤装置
有机滤膜(≤0.5 µ m)/水溶性滤膜(≤0.45 µ m) 膜片可更换
– 一次性使用的膜“Cartridge‖
使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理
高速离心
大于：10,000rpm
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超滤
机理
– 超滤是一种基于分子ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分离的技术
色谱泵的维护保养
流动相要过滤
常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水 冲洗柱塞杆清洗孔 关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不 互溶，要用一种中间溶剂过渡 色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯 甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中
排气后的色谱泵即可用于实验运行
– 注意∶
排气后，先设流速为 0 恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱 如需要，恢复排气时断开的控制线
根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值
若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡 (包括排气操作)
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2 星期 1 星期 1天
1 小时 新鲜配制 0
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5
10 分
15
20
25
保存于棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
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液相色谱对流动相的要求
液相色谱仪器对流动相的要求∶
– 与检测器匹配 – 脱气 – 避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统） – 溶剂的粘度
– 防止细菌的生长
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流动相的脱气
流动相脱气的目的
– 使色谱泵的输液准确
色谱柱对流动相的要求
– 过滤除去微粒 – 纯度的要求
超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水 有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)， 并与填料相匹配
– 缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内 – 缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM) – 流动相对样品的溶解度
调整有机溶剂和水的比例 最好用流动相溶样
面板操作 :
–打开状态(Statas)画 面 –按右下角Direct Function功能键 –选 Dry Pime或 Wet Prime命令 –选OK 即可进行泵的排气
注:
–当流路中充满空气时,
按图示做Dry Prime –若只是更新流动相时, 只须作Wet Prime
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匀的氧化膜
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色谱泵及系统的清洗
清洗液用30%磷酸水溶液
30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀
清洗步骤如下:
– 取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器 – 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) – 用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟 (四元泵的A,B,C,D四路各为25%) – 换成清水洗至出口水pH显中性 – 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
柱塞杆 清洗孔
泵体
排液阀
泵灌注阀
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Waters 2695 分离单元
溶剂瓶盘 检测器接液盘 前面板显示 屏和键盘 软盘驱动器 样品室门 溶剂输送单 元进入门 溶剂配比单元 进入门
注射器箱门 柱温箱
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2695排气操作示意图
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色谱泵及系统的钝化
钝化液用6M硝酸水溶液 6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀 钝化步骤如下:
– – – – – – 在清洗步骤完成后进行钝化处理 确认清洗用的磷酸已基本洗净 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟 换成清水洗至出口水pH显中性 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用