waters e2695高效液相色谱

高效液相色谱如何工作

检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再 将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。

定性和定量样品内溶物浓度。
由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。 如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。 如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。 如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光 散射检测器[ELSD]。 最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器 可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可 得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之 为液质联用.
样品方面要求

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除 由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小 颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也 会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度,如样品的溶剂不是流动相，一定要确 保样品在流动相中不析出。 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用。
打开真空脱气机（degasser）
Wet prime（执行湿灌注）
流动相平衡色谱柱
同理温度、流速都可在此控制面板设定！
流动相特性



（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变， 极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非 极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环 > 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷> 氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
定的检测器的参数的设置→设置好选另存为保存此仪器方法
→关闭）此时上述编辑的仪器方法出现在列表中
运行样品

在浏览项目中打开你的项目，通过“新建方法组” 来设定具体仪器方法、处理方法、报告方法→另 存为“方法组”，设置方法名（与刚才的仪器方法 名相统一）→完成。
在“运行样品”中打开设定的仪器方法， 并在设针时选定设定的方法组来对样品进 行分析。
流动相方面要求

除去微粒 纯度的要求


超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白 检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 有机溶剂或水的比例

流动相对样品的溶解度
溶剂管理系统的准备

流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按 【 Menu/Status 】，进入“ Status （ 1 ）”屏幕
溶剂管理系统的准备
必须用色谱纯有机溶剂，水或缓源自文库盐要用超纯水；
水相流动相需要每48h重新配制，特别是100%含水流 动相；
检查6根管子是否均在液面下，必须保证6根管子全部 插到溶剂瓶底部。
1.夏季气温高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必须每天都要更新。 2.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。高低流速交替冲洗。
3. 配制的流动相使用前要脱气，常用超声脱气法：流动相放在超声波容器中， 用超声波振荡10-15min，此法效果一般，但比较方便。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗 及保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 8.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新 的 流动相中。 9.关机前先用水冲洗整个系统，移走缓冲液后再用有机相冲洗。 10.进样前检查色谱系统的各个接头是否有漏液。
高效液相色谱如何工作






一个储液瓶装有溶剂[称为流动相，因为溶剂是流动的]。 一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相的 流速，一般是毫升/分钟。 一个进样器[样品管理器或自动进样器]可以将样品导入[注射]连续的流 动相 ，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。 色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱 硬件包围住。 检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带[大多数化合物没有 颜色，所以人眼观察不到]。 流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯 化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。 注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。

广泛应用于各个领域：
医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……

在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
什么是高效液相色谱法

定量分析主要基于与标准品的比较
是其最大应用领域

定性分析；不是色谱的强项
基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器

对定量及定性分析的要求
灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用
打印机
四元梯度洗脱的溶剂输送系统 四通道在线真空脱气机 可容纳 120 个样品瓶的自动进样系统

柱温箱
液晶显示器
内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘
键盘用户界面及软盘驱动器
2 开机

打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测 器、计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自 检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。

峰底 － Peak Base
峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height



通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离
Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法



仪器组成及开机 溶剂管理系统的准备 样品管理系统的准备 运行样品 数据采集 报告打印 关机
Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法

仪器组成及开机 1 仪器组成
Waters e2695 分离单元 2498型紫外检测器 色谱管理工作站




运行样品

配置系统项目 管理数据（相当于新建文件夹），鼠标右键选新建，设定项 目名（设定后将出现在运行样品中）。

建立方法组并运行样品
在浏览项目中打开你的项目，通过“新建仪器方法”来设定
使用的仪器方法（即对配置系统一步选定的主机和检测器进 行参数设置）：仪器方法（新建→仪器方法，包括主机和选



色谱图 参数基本概念

死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间

保留时间，tR － Retention time
组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 － Dead volume

不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
数据采集完毕后，关闭检测器电源开关，以节省使用寿命。 使用完毕，按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进 样器、进样针和柱塞杆密封垫，确保 2695 分离单元已彻底冲洗干 净后，关闭电源开关。


处理数据并打印报告后，关闭计算机和打印机电源开关，并做使 用登记。
HPLC使用常见注意事项

色谱图 参数基本概念

峰面积 － Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差；σ － Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 － Tailing Peak


后沿较前沿平缓的不对称峰

前伸峰 － Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰
Waters e2695 型
高效液相色谱仪 操作方法
主讲人：马贵红 日期：2010-07-17
什么是高效液相色谱法

High Performance Liquid Chromatography
高效液相色谱法，简称：HPLC

是一种基于仪器方法的高效能分离手段：
高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵 敏度的检测器……
数据处理
都可以在“浏览项目”中完成。 点开“浏览项目”，选定要要浏览的项目， 确定后进入的界面中有如下内容：样品组、 进样、通道、方法、结果组、结果等。

PDA数据处理

在浏览项目中，点“通道”→双击要处理的原始数据（点查看图标） →进入查看主窗口→提取色谱图→点“处理方法向导”图标→新建 处理方法→峰1、峰2→积分区域（选定要积分的峰）→给出条件剔 除不要的峰→→→……→纯度匹配→PDA光谱对照→处理方法名→ 完成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出）→点“方法组”图


色谱柱的使用及操作

流动相的转换要缓慢 流速(压力)的变化幅度较小，比较稳定 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
样品管理系统的准备
装载样品盘（loading carousels）： 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打 开样品仓门，显示“ Door is Open ”屏幕，装入样品 盘，按【 Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。
标，选好后点“文件”下的“另存为”→“方法组”，设定即可。
至此选好处理方法。

结果处理：选好数据，右键选处理→选好方法组（上面设定好的）
点结果即可给出处理好的数据
注：通道无论什么时候给出的都是未处理数据。

FD数据处理： 点“处理方法向导”图标→新建处理方法→在新方法 （方法类型中选LC）→新建处理方法→峰1、峰2→积分区域（选定 要积分的峰）→给出条件剔除不要的峰→→→……→处理方法名→完 成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出） →至此选好处理方法。
色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信 号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留 时间。
← 色谱峰 峰高
峰宽
基线 ↓ 保留时间（分）
色谱图 参数基本概念

色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线

鬼峰 － Ghost Peak
并非由试样所产生的峰；亦称假峰
色谱图 参数基本概念

基线 － Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 － Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N － Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中 谱带宽度增加的现象

液相色谱的基本流程图
流动相
色谱柱
A B C
进样阀
检测器
D
E F
G
泵
泵输液
进样
分离
检测
记录
液相色谱的各部分示意图

液相色谱实验所需的基本参数--亦称色谱条件 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量

保留体积，VR － Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
报告打印
在结果中，选择图谱点打印，报告打印时，选择 设定好的报告模式，或者选择 “缺醒单个报告”模式 打印，在待打印的模式下可以编辑报告显示的信息， 比如表头，色谱图的显示范围，表格中所需内容等。
关机