2012胡萝卜组织培养

四、本实验—胡萝卜的接种培养
1、胡萝卜的切块处理
• • • • 2人/组，8瓶/组，留2瓶下次用； 把胡萝卜切成约4cm的段，怎么切呢？ 去除表皮，去除木质部和髓； 切成约40×20×10 mm的条状，共切4块。
皮层 形成层
木质部
韧皮部
2、消毒和清洗
• • •
把切好的材料，放在100 mL的烧杯里，加入75％ 酒精（现配100mL ），浸泡30秒； 然后将外植体转入0.2％升汞中（100mL烧杯装 100mL升汞），浸泡25－30分钟； 把带有升汞的烧杯拿到超净工作台，取出材料， 放入培养皿，用无菌水洗4－5分钟，重复3次。
• 在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养 基上，每瓶接种2~4个，防止交叉污染。
• 接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿 用无菌胶带封口。
三、无菌操作步骤
• 接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开紫外线 灯进行杀菌； • 接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； • 接种员洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，换穿拖鞋等； • 上工作台后，用酒精棉球搽拭双手（特别是指甲处）和工作 台面； • 用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一 遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； • 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳 嗽等； • 接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟， 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
• 无菌操作
材料经升汞消毒后，还需严格进行无菌操作；为防 止染菌，手要用酒精擦干净，镊子和刀经常在火焰 上烧，锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。
• 废液处理 实验完后，75%酒精和工业酒精，均应倒回到工业 酒精的罐中 ；升汞有剧毒，小心不要溅出，废液倒 回原处；酒精和升汞千万别搞混。
六、常见错误举例
预备任务
• 2人/组， 2组/1个无菌操作台。
• 每组取如下工具放于无菌操作台上先行灭菌 从306取培养皿、镊子； 从316室取1瓶无菌水和8瓶培养基； 带1个500 mL的烧杯，作废液缸；1个250 mL的烧杯装工业 酒精100mL。 • 注意 放置物品时，先关灭紫外灯，放好后，关上门，再开启紫 外灯； 托盘不能放到无菌操作台里，要带回来。
3、接种与培养
• 把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的 培养皿里，去除表面一层，然后切成约 8×8×5 mm的块； 把切好的材料，用烧过的镊子夹到锥形瓶里， 2~3块/瓶，包好封口膜和牛皮纸； 将培养基放回316原位，在23~28℃恒温避光 条件下培养。
• •
五、注意事项
• 防火
实验中要常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具， 注意安全；手上涂酒精，要干后才能接近火源。
2、外植体的表面消毒处理
• 外植体的表面清洗：洗衣粉清洗，吐温。 • 外植体表面灭菌（一般采用2次灭菌法）
先用70%酒精浸10～30s；
转到其它消毒溶液，灭菌液要充分浸没材料。
• 无菌水涮洗
涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类， 涮洗3-l0次左右。
灭菌剂 酒精 氯化汞 漂白粉 次氯酸钙
使用浓度 （%） 70-75 0.1-0.2 饱和溶液 9-10
• 材料切得过小。 • 材料消毒时间过长。
• 切材料时下面没垫滤纸。
• 镊子、刀在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里。 • 操作时，手、三角烧瓶在盛材料的培养皿上方活动， 容易把菌带到材料上。 • 把接种的切块压入培养基里面。
• 接种时瓶口垂直向上，手、镊子上的脏物掉到瓶里。
• 升汞回收倒入酒精桶里。
一、组织培养基本原理
• 全能性
植物体的每一个完整的细胞都拥有 形成完整植株的全部遗传信息，在一定 的条件下都具有产生一株完整个体的潜 在能力。
• 去分化 去除外植体原有的分化性状，重新进入新 的发育分化状态。
二、组织培养的方法和步骤
1、培养材料的采集
• 选择原则： 根据培养目的、易于诱导、带菌少。 生理状态：幼嫩的组织 取材季节：易成活，wk.baidu.com长旺盛 植物的长势：生长健壮的组织 外植体大小：应根据培养目的而定 胚胎培养或脱除病毒，则外植体宜小； 快速繁殖，外植体宜大。 一般外植体大小在0.5～1.0 cm为宜。
消毒难易 易 较难 易 易
灭菌时间 0.1-3 2-10 5-30 5-30
灭菌效果 好 最好 很好 很好
次氯酸钠
过氧化氢 抗菌素
2（活性氧）
10-12 4-50mg/L
易
最易 中
5-30
5-15 30-60
很好
好 较好
3、制备外植体与接种
• 将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊子等，在 无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和 种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁 用手接触材料。
七、课后作业及预习
• 课后作业
有几种常用的外植体消毒液？主要原理是什 么？效果如何？
• 预习
根癌农杆菌转化的原理及方法。
实 验
•
步
骤
材料处理 安全第一 1）配75%酒精，倒升汞； 2）把胡萝卜切成约4cm的段； 3）去除表皮、木质部和髓，切成约40×20×10 mm方块，4条。 • 消毒和清洗 4）把切好的材料，放在100 mL的烧杯里，加入75％酒精，浸 泡30秒； 5）然后将外植体转入0.2％升汞中，浸泡25~30分钟，不能超 过30分钟； 6）把带有升汞和组织材料的烧杯拿到超净工作台，取出材料， 放入培养皿，用灭菌水洗4~5分钟，重复3次，用滤纸吸干。 • 接种与培养 7）把洗净的材料用烧过的镊子夹到盛有滤纸的培养皿中，去 除表面一层，然后切成约8×8×5 mm的块； 8）用烧过的镊子将外植体放到培养基上，3块/瓶； 9） 盖好封口膜和牛皮纸，放回316，23~28℃，避光培养。