研究生基本实验技能培训

30cycles
72 ℃， 30s
72 ℃，30s （后延伸）
2.2
PCR操作步骤（重点）
1. 计算好所需扩增的PCR体系； 2. 打开PCR仪预热，设置PCR循环条件； 3. 准备试剂，融化，离心，置于冰上，备用； 4. 按顺序加样，混匀，离心，分装； 5. 加入模板DNA，混匀，离心； 6. 放入PCR仪，Start。
研究生科研实验教学基地建设 基本实验技能培训
首都医科大学附属北京朝阳医院 基础医学研究中心 ·梁燕
85231624,
liangyan1990@shou.com
主要内容
1.DNA的提取
DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项 PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项
2.PCR
3.琼脂糖凝胶电泳
操作步骤（重点）
7. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW， 12000rpm离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管； 8. 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW， 12000rpm离心 30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管； 9. 将吸附柱和收集管再次离心， 12000rpm离心2分钟， 将吸附柱至于室温放置数分钟； 10. 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位 置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分 钟， 12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中； 11. 测OD值，计算DNA浓度和纯度；或电泳估计DNA浓 度。
3.琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项
作
业
实验记录 • 姓名，日期，试剂批号等 Fra Baidu bibliotek 实验设计 DNA提取步骤 PCR体系和循环条件 配胶和电泳方法
计算公式：
OD260/OD280=1.7-1.9
DNA浓度(ug/ul)=OD260×50×稀释倍数/1000 OD260=0.1 稀释倍数=250 DNA浓度=0.1×50 ×250/1000=1.25 ug/ul
操作注意事项
避免样品反复冻融 56℃水浴摇匀可消除GB中的沉淀
使用台式离心机，室温离心
子（灭菌）、离心管架
试剂准备：
试剂盒、无水乙醇等
试剂盒
试剂盒内容
操作步骤（重点）
1. 向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇，并标记； 向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇，并标记； 2. 取200ul全血，加入20ul的蛋白酶K溶液，混匀； 3. 加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10分 钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。 4. 加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出 现絮状沉淀。 5. 将吸附柱CB3放入收集管中准备好，将上述溶液移到 吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中 的废液，将吸附柱放回收集管；如果步骤5的溶液不 能一次加完，可以再次重复步骤6； 6. 向吸附柱中加500ul的缓冲液GD， 12000rpm离心 30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；
2.3
PCR操作注意事项
避免试剂反复冻融
计算总量，顺序加样
更换吸头，避免污染
3.琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项
3.1
琼脂糖凝胶电泳原理
DNA分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极； 其移动速度与线性DNA片段长度成反比。
3.2
琼脂糖凝胶电泳方法（重点）
• 配置1%的胶：称1g琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入 100ml的1*TAE，微波炉加热至完全融化； • 待凝胶温度降至50-60度时，加入1ul的EB（10mg/ml)， 摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却30-60 分钟； • 轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入1*TAE，没过 加样孔； • 按照1ul上样Buffer+5ul的DNA混合后，点样；每排留 一个孔加DNA marker； • 100V电泳30分钟，凝胶成像仪照相。
Primer F (10mM)
Primer R (10mM) Ex Taq Sum
Template DNA （0.1ug/ul)
1ul
1ul 1ul 24ul 1ul
2ul
2ul 2ul 48ul 48/2=24ul 1ul
(1U/ul)
95℃，30s （预变性）
95℃， 30s
60 ℃， 30s
3.3
电泳操作注意事项
带手套操作EB
凝胶完全融化
凝胶冷却时间至少30分钟
应用BclI/RFLP 多态位点进行基因连锁分析
M
II-3
II-2
II-1
I-2
I-1
0
374 211 163
小
1.DNA的提取
DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项
结
2.PCR
PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项
PCR体系和循环条件 PCR操作步骤 操作注意事项
2.PCR
仪器准备：
PCR仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头
（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架
试剂准备：
ddH2O, PCR Buffer，dNTP，引物，PCR聚合酶， DNA模板
2.1
PCR体系和循环条件（重点）
BclI PCR Total volume ddH2O 10×Buffer dNTP (25mM) 25ul *2 16.5ul 2.5ul 2ul 33ul 5ul 4ul
凝胶电泳原理 电泳方法步骤 操作注意事项
1.DNA的提取
DNA提取原理 DNA提取方法 操作注意事项
1.1
基因组DNA提取原理
既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离， 又要保持DNA分子的完整。
1.2
仪器准备：
基因组DNA提取
台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、
移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊