二甲双胍对大鼠脊髓损伤后内质网应激和细胞凋亡的影响

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CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.42 No.2 2019 解剖学杂志 2019年第42卷第2期
二甲双胍对大鼠脊髓损伤后内质网应激和细胞凋亡的影响*
郭卫东1，2 李 刚3 范仲凯1△
（1 锦州医科大学附属第一医院骨科， 锦州 121001；2 空军军医大学唐都医院骨科， 西安 710000；
3 同济大学附属上海第十人民医院骨科， 上海 200072）摘要 目的：研究二甲双胍（MET ）对大鼠脊髓损伤（SCI ）后内质网应激（ERS ）和细胞凋亡的影响，探讨二甲双胍对SCI 的保护作用及机制。

方法：
成年雌性SD 大鼠随机分为3组，分别是假手术组（Sham 组）、单纯脊髓损伤组（SCI 组）和二甲双胍干预组（MET 组）。

采用Allen 方法制备大鼠SCI 模型，MET 组和SCI 组大鼠建模后，立即腹腔注射MET （50 mg ·kg -1·d -1）或等量生理盐水，连续处理7天后，取脊髓组织，用实时定量PCR 检测各组脊髓组织中葡萄糖调节蛋白78 （ GRP78），CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP ） 和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（caspase-12）的mRNA 水平，免疫印迹检测各组脊髓组织中GRP78、CHOP 、caspase-12和active caspase-3的蛋白水平，免疫荧光染色检测各组脊髓组织中GRP78、CHOP 和caspase-12的蛋白水平，TUNEL 染色法检测各组脊髓组织中细胞凋亡水平，BBB 评分检测大鼠SCI 后运动功能情况。

结果：与Sham 组相比，SCI 组中GRP78、CHOP 和caspase-12的mRNA 和蛋白水平明显升高，active caspase-3蛋白表达和细胞凋亡数目明显增加，BBB 评分明显降低；与SCI 组相比，MET 组中GRP78、CHOP 和caspase-12的mRNA 和蛋白水平明显降低，active caspase-3蛋白表达和细胞凋亡数目明显减少，BBB 运动评分明显升高。

结论：二甲双胍可以抑制大鼠SCI 后细胞凋亡，促进后肢运动功能恢复，其机制可能与抑制ERS 有关。

关键词 脊髓损伤；二甲双胍；内质网应激；细胞凋亡；大鼠
Effects of metformin on endoplasmic reticulum stress and apoptosis
after spinal cord injury in rats *
Guo Weidong 1， 2
， Li Gang 3， Fan Zhongkai 1△
（1. Department of Orthopedics ， First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical College ， Jinzhou 121001； 2. Department
of Orthopedics ， Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University ， Xi'an 710000； 3. Department of Orthopedic ，
No.10 Affiliated Shanghai People's Hospital of Tongji University ，
Shanghai 200072， China ）Abstract Objective ： To detect the effects of metformin (MET) on ER stress and apoptosis after spinal cord injury (SCI) in rats. Methods ：Adult female SD rats were randomly divided into three groups ： sham group (Sham group)， spinal cord injury group (SCI group) and MET intervention group (50 mg/kg/day). SCI rat model was established at T10 section by Allen's weight drop method. Spinal cord tissues were harvested 7 days after spinal cord injury. Real-time quantitative PCR was used to detect the expressions of GRP78， CHOP ， and caspase-12 mRNA. The expression of GRP78， CHOP ， caspase-12， and active caspase-3 was detected by Western blotting and immunofluorescence labeling technique. The fluorescent TUNEL staining was used to detect apoptosis. The BBB score was used to detect the recovery of hindlimb motor function in rats. Results ：Compared with sham group ， the mRNA and protein levels of GRP78， CHOP ， and caspase-12 were significantly increased and so were the protein levels of active caspase-3 and the number of apoptosic cells ， while the BBB scores were decreased significantly in SCI group. Compared with SCI group ， the mRNA and protein levels GRP78， CHOP ， and caspase-12， and the protein levels of active caspase-3 were significantly reduced ， and the apoptosis had the same trend ； however ， BBB scores were increased significantly in MET group. Conclusion ： Metformin may inhibit the apoptosis ， and promote the recovery of hindlimb motor function by inhibiting endoplasmic reticulum stress after spinal cord injury in rats.
Key words spinal cord injury ； metformin ； endoplasmic reticulum stress ；
apoptosis ； rat * 辽宁省自然科学基金（201602277）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目（LJQ2014091）
第1作者 E-mail ：guoweidonggwd@
△
通信作者，E-mail ：fanzk_ln@
收稿日期：2018-10-08；修回日期：2019-01-12
doi ： 10.3969/j.issn.1001-1633.2019.02.012
·论 著·
脊髓损伤（spinal cord injury ，SCI ） 是脊柱外科常见疾病，由于人们尚未透彻地认识到SCI 的机制，导致至今仍未发现治疗SCI 的特效药物。

大量
研究证实，SCI后出现神经细胞凋亡事件，抑制神经细胞凋亡可明显减轻SCI后的运动功能障碍[1]。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）的主要功能是折叠和组装细胞内蛋白质，当其受损伤时会产生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），在初期细胞会启动未折叠蛋白反应（enfolded protein response，UPR）以缓解ERS对细胞产生的危害[2]，但持续、剧烈的ERS会诱导细胞进入凋亡程序[3]。

二甲双胍是目前临床上治疗2型糖尿病的经典药物，但其除了降血糖外，还在多种中枢神经系统疾病中发挥治疗作用，包括帕金森病[4]、亨廷顿病[5]和缺血性脑损伤[6]。

最新研究表明二甲双胍可以明显减轻SCI后运动功能障碍，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路[7]，减少了细胞自噬底物P62蛋白含量，同时上调微管相关蛋白Ⅰ轻链3Ⅱ（microtubule-associated proteinⅠlight chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）和Beclin 1表达，这表明二甲双胍对脊髓损伤的保护作用与促进细胞自噬体产生和增强细胞自噬降解有关，这两者共同维持了细胞内自噬体产生与降解过程平衡[8]，但关于其对SCI后的ERS的影响的报道非常少。

本课题通过检测二甲双胍对大鼠SCI后ERS及细胞凋亡的影响，探究其对SCI的保护作用及机制，为SCI损伤机制和干预靶点的选择提供重要线索。

1 材料和方法
1.1 实验动物与试剂
36只清洁级健康雌性SD大鼠（体质量250~300 g）购买于锦州医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（辽）2008-000。

二甲双胍购自美国MedChem Express公司；兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78（ glucose-regulated protein 78-kD，GRP78）多克隆抗体（ab21685）、小鼠抗大鼠CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/ enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）单克隆抗体（ab11419）、兔抗大鼠半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（cysteinyl aspartate specific proteinase-12，caspase-12）多克隆抗体（ab62484）和兔抗大鼠活化型半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（active cysteinyl aspartate specific proteinase-3，active caspase-3）多克隆抗体（ab49822）均购自英国Abcam公司；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体（sc-47778）购自美国Santa Cruz公司；HRP标记二抗山羊抗兔（7074P2）和
山羊抗小鼠（7074P6）均购自美国Cell Signaling Technology公司；荧光标记二抗Alexa Fluor 488结合的羊抗兔IgG（A-11034）和Alexa Fluor 594结合的羊抗小鼠IgG（A-11005）均购自美国Life Technologies公司；增强型ECL化学发光试剂盒（WBKLS0100）和PVDF膜均购自美国Millipore公司；TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（12156792910）购自瑞士Roche公司；Tissue-Tek O.C.T. Compound（4583）购自美国SAKURA公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒和SYBR® Green 反转录PCR试剂盒均购自大连TaKaRa公司。

1.2 实验分组及处理
大鼠先喂养1周，充分适应环境后随机将大鼠分为假手术组（Sham组）、单纯脊髓损伤组（SCI组）和二甲双胍干预组（MET组）（n=12）[8]。

Sham 组大鼠暴露脊髓，但不打击。

SCI组和MET组大鼠SCI模型的建立参照本课题组前期模型制备方法。

MET组和SCI组大鼠在建模之后立即腹腔注射MET（50 mg/kg）或等量生理盐水，连续干预7 d[8]。

每组大鼠均随机分为两亚组，均于SCI后7 d 处死，一亚组首先进行大鼠后肢运动功能（Basso Beattle Bresnahan，BBB）评分检测，然后处死用于实时定量 PCR和Western Blot检测，另一亚组用于免疫荧光标记技术和荧光TUNEL法检测。

1.3 行为学评分
根据文献报道的方法分别于伤后7 d对各组大鼠进行后肢运动功能BBB评分检测[1， 9]。

由2 位熟悉BBB评分细则的观察者进行各组大鼠行为学评分，然后取平均值来反映大鼠运动功能恢复情况。

1.4 实时定量PCR
造模7 d后，腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/ kg）深度麻醉，迅速取下第9胸椎~第11胸椎（T9~T11）脊髓节段，用预冷生理盐水冲净脊髓组织中血液。

将所取脊髓节段以打击部位为中心平分为两部分，其中一部分用TRIzol试剂提取总RNA用于目的mRNA的检测，另一部分用于后续免疫印迹检测。

通过A260/A280的比值（正常值范围1.7~2.1）评价RNA的纯度。

GRP78、CHOP、caspase-12和β-actin（内参）引物由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。

引物序列：（1）GRP78：5'- CATAGCCAACGATCAGGGCA-3'，5'- TCATTCCAAGTGCGTCCGAT-3'；（2）CHOP：5'-C C A G C A G A G G T C A C A A G C A C-3'，5'- CGCACTGACCACTCTGTTTC-3'；（3）caspase-
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12：5'- CACTGCTGATACAGATGAGG-3'，5'- CCACTCTTGCCTACCTTCC-3'；（4）β-actin：5'-C G C T T C G G C A G C A C ATATA C-3'，5'- TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3'。

根据cDNA反转录试剂盒的操作说明合成 cDNA。

根据SYBR®Green 反转录PCR试剂盒说明书的扩增条件，在CFX96™ 反转录PCR仪中进行，反应第一步95 ℃，30 s，紧接着 40个循环（95 ℃，5 s；60 ℃，30 s）。

以内参β-actin mRNA的CT值标准化目的mRNAs 的CT值，用2-ΔΔCT分析方法计算样本目的基因相对表达量。

1.5 免疫印迹
将上述实时定量 PCR检测过程中剩余的另一部分脊髓组织采用RAPI裂解液提取总蛋白用于检测各目的蛋白。

用BCA法检测完各组样品蛋白浓度后，取30 μg蛋白于10%或12% SDS-PAGE电泳并转印至PVDF膜上；1％BSA室温封闭2 h，然后分别用GRP78、CHOP、caspase-12、active caspase-3和β-actin一抗（均1∶1 000）4 ℃孵育过夜；TBST洗膜液充分洗膜，用HRP标记二抗山羊抗兔和山羊抗小鼠（均1∶2 000）室温孵育2 h；然后凝胶成像系统曝光。

用Image J软件求出目的蛋白和β-actin的灰度值之比，以反映各蛋白表达水平。

1.6 免疫荧光技术
腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）深度麻醉SD大鼠，仰卧位开胸暴露心及主动脉，先用灌注泵将50 ml生理盐水快速灌入主动脉内，同时剪开右心耳，待大鼠体内血液被冲洗干净后，用4% 多聚甲醛体内先快速灌注5 min（20 ml/min），然后缓慢灌注15 min（10 ml/min），取出大鼠T9~T11脊髓节段，继续置入盛有4% 多聚甲醛棕色瓶内固定至少24 h，然后将T9~T11脊髓节段放入30%蔗糖溶液，4 ℃待脊髓组织沉到瓶底，OCT包埋，冷冻切片机冠状切片，切片厚度为6 μm。

以打击部位为中心，向两边开始切片，为防止同时计数同一细胞，每隔16张取一张片子（约间隔100 μm），每组6只，每只选3张，分别用于GRP78、CHOP 和caspase-12蛋白检测。

5%山羊血清室温封闭1 h，甩掉载玻片上封闭血清，直接加上述一抗（均1∶500）保湿盒内４℃孵育过夜，PBST洗片，山羊抗兔和山羊抗小鼠的荧光二抗（均1∶250 ）保湿盒内室温避光孵育2 h，PBST洗片，DAPI室温避光孵育2 min，PBST充分洗片，60%甘油封片，荧光显微镜下观察。

镜下随机选取脊髓前角不重叠
的2个视野用于统计GRP78和caspase-12的平均荧光强度（400×）和CHOP阳性细胞百分比（200×）。

Image J软件用于计算平均荧光强度。

平均荧光强度= Integrated Density/Area。

蓝色细胞核数目代表细胞总数。

阳性细胞比例 = （阳性细胞数/蓝色细胞核数）[9]。

1.7 荧光TUNEL染色法
所用脊髓组织切片制备同上，荧光TUNEL操作步骤按照试剂盒说明书进行。

每组6只，每只选1张，荧光显微镜随机选取脊髓前角不重叠的6个视野（×400），观察拍照。

视野中红色细胞核数代表凋亡细胞数，蓝色细胞核数目代表细胞总数。

凋亡细胞比例=红色细胞核数/蓝色细胞核数。

1.8 统计学处理
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。

所得数据均以x±s表示。

多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。

2 结果
2.1 大鼠SCI 7d后运动功能评分情况
SCI组（21）中大鼠BBB评分较Sham组（4.1±0.6）明显降低（P<0.05）； MET组（7.3±1.6）中大鼠BBB评分较SCI组明显升高（P<0.05），这说明二甲双胍可以明显减轻大鼠SCI运动障碍（图1）。

图1 大鼠运动功能BBB评分
Fig 1 BBB score of motor function of rats
*P<0.05 vs sham group；△P<0.05 vs SCI group
2.2 大鼠脊髓组织中GRP78、CHOP和caspase-12 mRNA表达水平
实时定量 PCR检测结果显示：与Sham组（均为1）相比，SCI组中GRP78（2.5±0.3）、CHOP （3.1±0.5）和caspase-12（1.9±0.2）mRNA表达均明显升高（P<0.05）；而与SCI组相比，MET 组中GRP78（1.6±0.2）、CHOP（2.0±0.2）和caspase-12（1.4±0.1） mRNA表达明显降低（P<0.05）（图2）。

B
B
B
s
c
o
r
e
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2.3 大鼠脊髓组织中GRP78、CHOP 和caspase-12蛋白表达水平
免疫印迹结果显示：caspase-12有2个条带，分别是pro-caspase-12和cleaved caspase-12；与Sham 组（0.10±0.02，0.11±0.04，0.30±0.08和0.05±0.02）相比，SCI 组中GRP78（0.46±0.10）、CHOP （0.87±0.16）、caspase-12（0.66±0.14）和cleaved caspase-12（0.27±0.05）蛋白表达均明显升高（P <0.05）；而与SCI 组相比，MET 组中GRP78（0.24±0.06）、CHOP （0.46±0.08）、caspase-12（0.33±0.10）和cleaved caspase-12（0.13 ±0.03）蛋白表达明显降低（P <0.05） （图3）。

免疫荧光结果显示：荧光显微镜观测部位是脊髓前角。

与Sham 组（0.025±0.005，0.010±0.012和
0.011±0.003）相比，SCI 组中GRP78（0.120±0.040）、CHOP （0.163±0.044）和caspase-12（0.100±0.024）蛋白表达均明显升高（P <0.05）；与SCI 组相比，MET 组中GRP78（0.050±0.010）、CHOP （0.040± 0.006）和caspase-12（0.070±0.034）蛋白表达明显降低（P <0.05） （图4，见封三）。

这表明二甲双胍可以明显抑制大鼠SCI 后ERS 的发生。

图2 各组大鼠脊髓组织中GRP78、CHOP 和
caspase-12 mRNA 表达水平
Fig 2 Expression of GRP78， CHOP and caspase-12 mRNA
in the spinal cord of rats in each group *P <0.05 vs sham group ；△P <0.05 vs SCI group
图4 各组大鼠脊髓前角中GRP78、 CHOP 和 caspase-12蛋白表达水平
Fig 4 Expression of GRP78， CHOP and caspase-12 proteins at anterior horn of spinal cord of rats in each group A-C and J ： GRP78 immunofluorescent pictures and statistical histograms ， ×400；D-F and K ： CHOP immunofluorescent pictures
and statistical histograms ， ×200；G-I and L ： caspase-12 immunofluorescent pictures and statistical histograms ， ×400.
A ， D and G ： Sham group ；
B ， E and H ： SCI group ；
C ， F and I ： MET group. *
P <0.05 vs sham group ；
△
P <0.05 vs SCI group. Bar = 50 μm （GRP78 and caspase-12）， bar = 100 μm （CHOP ）
2-ΔΔC T f o l d c h a n g e
图3 各组大鼠脊髓组织中GRP78， CHOP
和caspase-12蛋白表达水平
Fig 3 Expression of GRP78， CHOP and caspase-12 proteins in the spinal cord of rats in each group
*P <0.05 vs sham group ；△
P <0.05 vs SCI group
R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f p r o t e i n
Sham
SCI MET
GRP78CHOP
Cleaved caspase-12
Caspase-12
G R P 78 m e a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y
J
R a t i o o f C H O P p o s i t i v e c e l l s
K
C a s p a s e -12 m e a n
f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y
2.4 大鼠脊髓组织中active caspase-3和细胞凋亡的情况
免疫印迹结果显示：与Sham 组（0.10±0.06）
相比，SCI 组（0.78±0.12）active caspase-3表达明显升高（P <0.05）；与SCI 组相比，MET 组（0.44±0.10）中active caspase-3表达明显降低（P <0.05） （图5）。

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荧光TUNEL 结果显示： SCI 组（0.43±0.10）细胞凋亡数目较Sham 组（0.015±0.020）明显增多（P <0.05）； MET 组（0.21±0.08）中细胞凋亡数目较SCI 组明显减少（P <0.05）（图6，见封三）。

这表明二甲双胍可以明显抑制大鼠SCI 后细胞凋 亡。

3 讨论
ERS 作为全身应激反应的重要组成部分，参与了中枢神经系统损伤的病理过程 [10-13]。

ERS 是一种高度保守的细胞反应机制。

GRP78作为内质网分子伴侣，参与调节UPR 的双链RNA 活化的蛋白激酶样内质网激酶（the dsRNA-activated protein kinase-like ER kinase ，PERK ），需要酶的肌醇1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）和活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）这3条信号通路 [14]。

研究表明细胞在ERS 初期会先通过启动UPR 来缓解ERS 对自身造成的损伤，但是持久剧烈的ERS 会导致 UPR 从促生存模式向促凋亡模式转变，进而激活凋亡相关通路 [2-3]。

细胞凋亡经典途径主要有3条：死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径，它们最终都通过激活caspases-3促进细胞凋亡 [15]。

目前ERS 介导的凋亡通路主要是CHOP 通路和caspase-12通路。

CHOP 是ERS 介导细胞凋亡的标志性基因，其主要通过下调抑凋亡蛋白Bcl-2 及上调促凋亡蛋白来促进线粒体内细胞色素C 释放，进而激活线粒体途径 [16]。

Caspase-12前体正常情况下位于内质网上，但当其被激活后会转移至细胞质中进一步激活caspase-3，最终诱导细胞凋亡 [17]。

因此，抑制SCI 后CHOP 通路和
caspase-12通路的激活能有效抑制神经细胞凋亡，促进神经功能恢复。

二甲双胍是治疗2型糖尿病的经典药物，其除了可以明显降低血糖外，还可以有效缓解多种中枢神经系统疾病 [4-8]。

Patil 等 [4]报道二甲双胍可
以通过上调脑源性神经营养因子表达，抑制氧化应激来保护帕金森病小鼠神经元。

Liu 等 [5]报道
二甲双胍可以减轻小鼠缺血性脑损伤，其机制与激活5'-磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（5'-adenosine monophosphate activated protein kinase ，AMPK ）信号通路，促进局部血管形成和神经再生有关。

Vazquez-manrique 等 [6]报道二甲双胍也可以通过激活亨廷顿病模型中AMPK 信号通路来改善神经元功能。

值得注意的是，最新研究表明二甲双胍可以增强SCI 后自噬流，抑制神经元凋亡 [7]，减轻血脊髓屏障的破坏，从而改善SCI 后运动功能 [18]，但其对SCI 后的ERS 是否有影响尚不清楚。

Tan 等报道大鼠创伤性脑损伤后ERS 被激活，抑制ERS 可减轻后的继发性脑损伤，保护脑组织 [11]。

Ohri 等报道小鼠SCI 后神经元和少突胶质细胞中CHOP 蛋白表达明显增多，抑制脊髓组织中CHOP 表达可以明显缓解小鼠后肢运动功能障碍 [3]。

Saraswat 等报道敲除ATF6α虽然可以抑制小鼠SCI 后ERS ，但对后肢运动功能未见明显影响 [12]。

近年来大量研究表明，黄连素 [13]、神经生长因子 [19]、丁苯酚 [20]、β-榄香烯 [21]、氯化锂 [22]、氯喹 [23]、西洋参茎叶总皂苷 [24]和甲氨蝶呤 [25]等均可以通过减轻ERS 和神经细胞凋亡，促进大鼠SCI 后运动功能恢复，这些研究表明干预脊髓损伤后ERS 可能是未来治疗SCI 重要靶点。

本研究结果显示二甲双胍可以明显下调SCI 后GRP78、CHOP 和caspase-12的mRNA 和蛋白的表达，抑制了caspase-3的活化及细胞凋亡，明显缓解了SCI 导致的后肢运动功能障碍，这表明二甲双胍可能通过下调大鼠SCI 后CHOP 和caspase-12转录和翻译，从而抑制了凋亡执行蛋白caspase-3的活化，最终减少了神经元凋亡，促进了大鼠SCI 后运动功能恢复，支持了上述的研究 [3，8，19-25]。

鉴于SCI 后ERS 是把双刃剑，初期的UPR 具有自我修复ER 功能，因此，有必要进一步选择多个时间点给予二甲双胍治疗，以求发现最佳治疗时机，让机体自我修复和外界干预治疗发挥联合作用。

综上所述，二甲双胍可以减轻大鼠SCI 后ERS 介导的细胞凋亡，促进后肢运动功能恢复。

本研究提示二甲双胍有望成为SCI 合并糖尿病患者的首选
图5 各组大鼠脊髓组织中active caspase-3表达水平
Fig 5 Expression of active caspase-3 of rats
in each group of rats
*P <0.05 vs sham group ；△
P <0.05 vs SCI group
A c t i v e c a s p a s e -3 r e l a t i v e e x p r e s s i o n
Sham
SCI MET
Active caspase-3
β-actin
药物，并印证了干预ERS诱导的细胞凋亡可能成为未来治疗SCI的新方法，为SCI的药物治疗提供了新靶点。

图版说明（见封三）
图6 各组大鼠脊髓组织细胞凋亡水平，×400。

A~C： DAPI标记的细胞核图片；D~F：荧光TUNEL标记的细胞核图片；G-I：同视野下2种荧光图的重叠图片； A， D和G：Sham组；B，E和H：SCI组；C， F和I：MET组
Explanation of figures (See inside back cover)
Fig 6 Levels of apoptosis in each group of rats，×400. A-C：DAPI labeled nucleus pictures；D-F：Fluorescent TUNEL
labeled nuclear pictures；G-I：Overlapping pictures of two
fluorescent images in the same field of view. A，D and G：Sham group； B，E and H： SCI group；C，F and I：MET
group.
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