动物基因工程

2、从外源基因随机插入（或整合）到定 点整合的转变
转基因在基因组中的存在方式有两种，即 随机整合和定点整合。 为了达到外源基因的高效表达，在转基因 结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基 质附着区(MAR)等调控元件，可以实现插入位 点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和 MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源 基因插入什么位点，都能够维持一个开放的染 色体结构，有利于基因的表达。 基因打靶技术的出现与发展，实现了对目 的基因的定位操作。
AAV具有以下几个方面特点： 非致病性、无免疫原性和无炎症反应 能感染静止期的细胞，如神经元细胞 插入的外源基因表达时间长，一般能够达 到1年之多 宿主范围广 热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯 化
（3）反转录病毒
反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主细 胞后，病毒颗粒中的pol基因表达出反转录酶，以单链 的RNA基因组为模板，立即转录出一份线形双链DNA 复本，然后在整合酶（Int）介导下，整合到宿主的基 因组内，此时整和的病毒序列被称为前病毒。 反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA 随宿主DNA的复制而复制，并由5`-LTR中的一个强启 动子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因组，同时又 具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白和反转录酶。 在宿主细胞质中，两条相同的RNA链和反转录酶被包 装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至 细胞外，但通常不致死宿主细胞。
1 .质粒型表达载体
表达载体的共同特点是都带有原核复制 区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能 够在大肠杆菌中扩增，同时也必须包括能在 真核细胞表达的相关组件。一般包括转录外 源DNA序列的启动元件、转录产物有效地加 上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核 细胞中的选择性标记，另外还增加了一些附 加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受 点，以保证外源基因的高效表达。
3 .定向打靶载体
基因打靶是通过外源基因与靶细胞染色 体上的同源序列间的同源重组，将外源 基因定点整合到靶细胞特定位置上，而 使某一个特定位点上的基因发生定点突 变的技术。 在细胞内存在两条相同的DNA链（同源 染色体），在细胞内酶的作用下，可以 将其切开，发生交叉，然后重新连接， 从而发生DNA链的交换并引发重组。
世界第一只转基因动物
世界首只转基因灵长类动物
——-安迪
HBV转基因动物树鼩
1、从简单的显微注射法向高效率的转基 因体细胞核移植方向发展
从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外， 人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚 胎干细胞介导法和核移植法等多种转基因方法。 转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产 的主流方法。
动物基因工程是利用DNA重组技术对动物 所进行的工程操作。 从遗传学角度分为： 遗传性动物基因工程：外源基因能够通过配 子进行垂直传递并稳定的遗传。 非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表 现，不能够遗传给子代。
第一节 动物基因工程的发 展状况与趋势
动物基因工程的实质是改变动物的 遗传组成，增加动物的遗传多样性， 赋予转基因动物新的表型特征，使能 够更好地服务与人类社会。
（2）腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）
腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性 单链DNA病毒，其复制需要有辅助病毒的共转 染。无共转染时，野生型AAV优先（70%） 整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在 直至被辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组 两端的ITR，以及非结构基因编码的蛋白 Rep78 和Rep68的存在。
第二节 转基因动物技术
一、动物基因工程载体 二、基因转移技术
一、动物基因工程载体
作为动物基因工程载体必须具备以下 几个功能： 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞内复制或整合 的能力 为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表 达能力
动物基因工程载体
质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
（3）基因下调（knock-down）
RNA干扰（RNA interference，RNAi）又被称 为基因下调，通过干扰RNA（smallinterference siRNA）分子的作用达到转录后基因沉默的效应。 siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和 siRNA表达载体两种。体外合成的siRNA易转染细 胞，进入细胞后，可直接发挥作用，一般不存在 siRNA 表达载体的转录效率低及细胞毒性等问题。 但是体外合成的siRNA 只能瞬间干扰，不能达到长 久抑制病毒的效果。
以山羊乳腺特性表达载体pBC1具备以下 基本条件： 携带外源基因并能够包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移与表达 对机体不致病
（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： • 基因组的重排率低 • 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个 周期 • 安全性好，不会整合到人的染色体上， 不导致肿瘤的发生 • 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂 期要求不高 • 外源基因在载体上容易高效表达
（1）基因敲除
敲除型载体由两段与基因组内靶基因座 序列同源的 DNA 片段（又称同源臂）组成， 中间为正向选择标记，同缘臂外侧为真核细 胞中的负选择标记及在原核细胞中进行复制 与筛选的载体DNA序列。
（2）基因敲入
基因敲入是利用同源重组原理将外源基因 插入到染色体的特定位点上。基因敲入的转基 因结构设计上相似于基因敲除结构，但区别在 于： 或用外源基因替换并失活靶基因 或在不影响拔基因功能的前提下插入新的基因 或在染色体上特定位点插入新的外源基因，从 而实现基因转移，并使得外源基因高效表达
３、从传统转基因到条件控制的转变
从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历 了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶 段为条件性转基因动物阶段。 借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入 高等动物的基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除， 实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新的基因 型和表型。 目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学 疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传 改良等５个方面。