分子生物学研究方法.

6． 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.
a.凝胶滞缓 实验(Gel retardation assay)， 又称DNA迁 移率变化试 验(DNA mobility shift assay-EMSA)。
b． DNase I 印迹试验（DNase I foot printing） • 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关 键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断 裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。 • 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合， 那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作 用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋 白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出 现了一个空白的区域,形象地称为足迹。
4． DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法 Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱 氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如 下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确 的DNA互补链； DNA聚合酶常用Klenow大片段， 无5'→3'外切酶活性。 ②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其 延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA， 引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA 聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种 ddNTP。
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图
b． DNA序列分析自 动化(分析反应\读 片过程 )
用四甲基若丹明 (Tetramethylrhoda mine)作为荧光剂 标记DNA引物，带 有这种引物的DNA 片段能在激光诱导 下发出荧光。按照 标准的双脱氧终止 法或化学终止法进 行测序反应，跑 DNA凝胶后,用计 算机检测。
DNA测序的全过程(实际)
5． 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个 特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过 程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋 白质工程的重要手段。 如： 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒 式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。
分子生物学研究方法
第一节 基因操作的主要技术 原理
1． 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide) 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一 定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用 下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成 正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与 分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质 的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离 子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离 子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场 中，它就会由负极→正极移动。
2． 核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶 电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交 之前，通过毛细管作用或电导作用按其在 凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到 滤膜上的。 常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素 滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM） 和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上， 这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、 斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。 所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的 车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成.DNA， ……
Mullis的第一个P源自文库R实验
1983年9月中旬。Mullis在反 应体系中加入DNA聚合酶 后在37℃一直保温。结果第 二天在琼脂糖电泳上没有看 到任何条带。于是他认识到 有必要用加热来解链，每次 解链后再加入DNA聚合酶 进行反应，依次循环。1983 年12月，他终于看到了被同 位素标记的PCR条带。
PCR的基本原理
• 引物 • dNTP
基本要素
• 耐热DNA聚合酶 • 模板DNA
• 变性（denaturation）：90～98℃；
延伸三个步骤。
Kary B. Mullis (1944 -)，在 Cetus公司工作期间，发明 了PCR。 他原本是要合成 DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板 DNA而烦恼。1983年春夏之 交的一个晚上，他开车去乡 下别墅的路上萌发了用两个 引物（而不是一个引物）去 扩增模板DNA 的想法…...
7 聚合酶链式反应（PCR）技术
PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反 应。1983年由美国科学家Kary Mullis提出，1993
年因此而获诺贝尔奖。PCR技术是指通过模拟体
内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个 特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、
3． 细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获 了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征 发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的 菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株 则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验 菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2 处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作 用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。