河南省甘薯脱毒技术研究现状及展望

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1 甘薯病毒病发生情况调查
1998- 2002 年, 在甘薯的不同生育期对杞县、 汝州、洛阳、郑州、许昌、禹州、南阳等地的 13 个甘薯 品种进行调查, 发现河南省甘薯病毒病发生非常普 遍, 品种感病率和田块发病率均为 100% , 田间病株 率为 60% ~ 90% 。虽然不同品种间发病率有差异, 但没有发现抗病品种[ 3] ; 甘薯地上部病毒症状主要 有叶斑、花叶、卷叶、叶片皱缩和叶片黄化等类型, 以 叶斑类型为主, 如紫色羽状斑、紫斑、黄斑等。薯块
3 甘薯病毒的检测技术研究
目前常用的病毒检测方法有目测法、指示植物 法、血 清 学 检 测 方 法 和 分 子 生 物 学 检 测 方 法 等[ 18, 19] 。以酶联免疫吸附法( EL ISA ) 为基础的血 清学检测方法和基于核酸的 P CR 和杂交检测技术 具有快速、特异、检测样品量大等特点, 是目前研究
在全省 10 个县 21 个点( 次) 进行的小区对比 试验结果表明[ 5] , 脱毒甘薯的增产效果非常明显, 增 产幅度为 17. 9 % ~ 176. 0 % , 平均 61. 8 % 。不 同品种间的增产幅度存在较大差异, 一般每公顷增 产鲜薯 2 593. 5~ 53 062. 5kg , 平均 14 703kg 。脱毒 甘薯在较大面积示范中也表现了良好的增产效果。 1998 年, 唐河县城郊乡权庄村种植 0. 2hm 2 脱毒甘 薯, 折产 60 378kg/ hm2, 比非脱毒甘薯增产 108% 。 社旗县1. 67hm2脱毒春薯, 产量平均达 50490kg/ hm2, 比未脱毒甘薯增产 70. 9% ; 5. 13hm2 夏薯平均产量 35175kg/ hm2, 比未脱毒甘薯增产 39. 6% 。1999 年, 南阳 卧 龙 区 种 植 40hm2 脱 毒 甘 薯, 产 量 平 均 达 30000kg/ hm2, 而未脱毒甘薯只有 20640kg/ hm2, 增 产 45. 3% 。
1979 年, 台湾学者在台农 65 号甘薯品种上首 次发现 SPL V [ 12, 13] 。该病毒侵染甘薯一般不产生明 显的叶部症状, 有的仅产生轻度斑驳。李汝刚等[ 14] 利用国际马铃薯中心制备的 SP LV 的抗体, 对采自
收稿日期: 2009- 06- 11 作者简介: 张振臣( 1964-) , 男 , 河南延津人, 研究员, 博士, 主要从事植物病毒研究。
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2009 年第 9 期
1997 年以来, 河南省农科院等单位利用茎尖培 养结合热处理等技术, 培养成功了豫薯 7 号、豫薯 12 号、豫薯 13 号、商薯 19、汝薯黄、徐薯 18、梅营 1 号、北 京 553、徐薯 34、郑红 11、苏薯 8 号、安平 1 号、济薯 18 等脱毒甘薯品种, 其中脱毒豫薯 7 号、12 号、13 号、汝 薯黄、梅营 1 号、郑红 11、苏薯 8 号、安平 1 号等品种 为首次培养成功并大面积推广应用[ 5] 。
SP V MV 是 P oty vi r us 属一个 新的暂定种[ 16] , SPVMV 也 称甘 薯 病毒 2 ( Sw eet p otat o vi rus 2, SPV2) 和 甘 薯 病 毒 Y ( Sw eet p otato vi rus Y, SPV Y ) 。上世纪 80 年代, R ossel 等[ 17] 首先从台湾 和尼日利亚甘薯上分离到该病毒。SPVY 病毒粒体 丝状, 长 850nm , 侵染细胞产生风轮状、卷轴状内含 物和由非结构蛋白构成的晶状物, 侵染寄主产生明 脉、花叶、畸形、褪绿等症状。靠桃蚜( M yzus pers-i cae) 以非持久方式传播, 也可机械传播。但以机械 传播方式系统侵染甘薯时, 必须先在甘薯上预先接 甘薯褪绿矮缩病毒( Sw eet po tat o chlo rot ic st unt v-i r us , SPCSV ) 。寄 主 范 围 与 SPL V 相 似。At eka 等[ 16] 克隆了 12 个来自中国、葡萄牙、南非和赞比亚 的 SPVM V 分离物 的 CP 基 因及 3'端非 编码区 序 列, 这 12 个分离物的核苷酸序列一致性在 81% ~ 99% , 氨基酸序列一致性在 86% ~ 99% 。
的重点。 在甘薯病毒快速检测技术研究方面, 河南省农
科院初步建立了几种甘薯主要病毒的检测技术。张 振臣[ 20] 、付振艳[ 11] 、黄玉娜[ 15] 等分别在大肠杆菌中 高效表达了 SPF MV、SP VG、SP LV 和 SPVM V 的 CP 基因, 通过纯化蛋白, 免疫家兔制备了上述病毒 的特异性抗血清, 并通过优化反应条件, 初步建立了 上述 4 种病毒的 EL ISA 检测技术。
上的症状以黑褐色或黄褐色龟裂纹为主[ 3~ 5] 。
2 甘薯病毒种类的分子鉴定
2. 1 甘薯 G 病毒 ( SPVG) 目前, SPVG 仅 在 中 国、埃 及 和 美 国 有 过 报
道[ 6 ~ 8] 。Co linet[ 9] 等利 用中 国广东 的甘 薯病 毒材 料, 克隆了 SPVG 广东 分离物( SPVG- CH ) 的外壳 蛋白( CP) 基因, 发现 SP VG- CH 的 CP 基因由 1 065 个核苷酸组成, 编码 355 个氨基酸残基, 是已知 Pot yvirus 病毒中外壳蛋白最大的一个。Colinet 等[ 10] 此后又鉴定到一个分离物 SPVG- CH 2, SPV G- CH 2 与 SPVG- CH CP 基因 的核苷 酸序 列一 致性 仅为 85. 4% , 氨基酸序列一致性为 93. 5% , 说明 SPVG 不同分离物之间存在较大的差异。付振艳[ 11] 等利 用 RT- PCR 方法克隆了 SPVG 河南分离物( SPV GH N) 的 CP 基因, 序列分析 表明, SPVG- H N CP 基 因 由 1 065 个 核 苷 酸 组 成 ( GenBank 登 录 号 为 DQ399861) , 编码 355 个氨基 酸残基, 与 GenBank 中 Eg ypt 1( AJ515380) 、L SU- 1( AY178991) 和 L SU3( AY178990) 分离物的核苷酸 序列一致性为 98% 左右, 与 中 国 广东 分 离 物 SPV G- CH ( X76944) 和 SPVG- CH 2( Z83314) 的核苷酸序 列一致性 分别为 98. 1% 和 85. 5% 。说 明 SPVG- H N 与 SP VG- CH 属同一类型, 而与 SP VG- CH 2 关系较远。 2. 2 甘薯潜隐病毒( SP LV)
在甘薯病毒的多重 PCR 和核酸杂交检测技术 研究方面, 设计了 SPL V、SP VG 和 SP FM V 3 种病 毒的特异性引物, 通过优化反应条件, 建立了可同时 检测上述 3 种病毒的多重 RT- PCR 检测技术, 即在 一次 PCR 反应中同时检测上述 3 种病毒, 有效地提 高了检测效率, 降低了生产成本。另外, 以非放射性 物质地高辛( DIG) 为标 记物, 制备 了 SP L V 的 cDNA 探针, 建立了可 有效区分 SP GV 和 SP FM V 的 核酸斑点杂交检测技术, 为 SPL V 的特异性检测提 供了一种简便、有效和安全的方法。 甘薯潜隐病毒 ( SP LV) 特异性探针 制备及快速检 测方法( 专利申 请号: 200810049089. 5) 和 三种甘 薯病毒的 多重 RT- PCR 检测方法( 专利申请号: 200810049503. 2) 申报了国家发明专利。
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河南农业科学
北京、江苏、四川和山东的 200 份甘薯样品进行了血 清学检测, 发 现上述 4 个省 ( 市) 甘薯上 普遍存 在 SPL V 。Colinet 等[ 13] 测 定 了 SPL V 台 湾 分 离 物 ( SPL V- T ) 和广东分离物( SPL V- CH ) 的 CP 基因, 发现 SP LV- CH CP 的 N 末端存在 P ot y vi rus 属病 毒蚜传所必需的 DAG 基序, 而 SPL V- T 的 CP 相应 位置则突变为 DT G, SP LV- T 和 SPL V- CH CP 基 因的核苷酸序列一致性为 93. 5% , 认为 SPL V- T 和 SPL V- CH 为 SPL V 的 2 个不同株系。黄玉娜[ 15] 等 利用 RT- P CR 方 法 克 隆 了 SPL V 河 南 分 离 物 ( SPVL- H N) 的 CP 基因及部分 3' 端非编码区序列, 序列分析表明, SPL V- H N CP 基因由 879 个核苷酸 组成( GenBank 登录号为 DQ399862) , 编码 293 个 氨基酸残基, 与 SP LV- CH 和 SPL V- T 分离物的核 苷酸序列一致性分别为 96. 8% 和 93. 0% , 与日本 分离 物 的 核 苷 酸 序 列 一 致性 为 83. 6% 。而 且, SPL V- H N 与 SPL V- CH 以及日本分离物一 样, CP 的 N 端存在 Poty v ir us 属病毒蚜传所特有的 DA G 基序。说 明河 南 分 离物 与 广东 分 离 物应 属 同 一 类型。 2. 3 甘薯脉花叶病毒( SP VMV)
5 脱毒甘薯的示范推广及增产效果
河南省农科院等单位制定了河南省甘薯脱毒及 繁育技术操作规程, 起草了脱毒甘薯的质量标准, 规 范了脱毒甘薯的生产场地、过程和病毒检测方法等。 在河南省初步建立了以河南省农科院为龙头, 由多 个市县参加的脱毒甘薯原原种、原种以及良种三级 繁育和供种体系, 使脱毒甘薯在河南省获得了较大 面积的应用。河南省从 1997 年开始示范推广脱毒甘 薯, 当年示范推广 0. 07 万 hm2, 1998 年 0. 67 万 hm2, 1999 年发展到 5. 3 万 hm2, 10 年来已累计示范推广 近 66. 7 万 hm2 。
4 脱毒技术研究及脱毒新品种的培养
河南省农科院对甘薯茎尖成苗培养及快繁培养 的培养基进行了研究, 筛选出了适合不同甘薯品种 的茎尖成苗和快繁培养基。在光照及激素对茎尖成 苗的影响研究方面, 黄冰艳等[ 21] 根据不同基因型甘 薯茎尖分生组织在不同激素水平的生长反应, 将 4 个河南主栽甘薯品种分为 3 类: 激素不敏感易成苗 型、激素敏感易成苗型和激素不敏感难成苗型, 并针 对每种类型提出了相应的调整培养基和激素水平、 改变光照时数和培养温度等具体措施, 使茎尖培养 成苗率达到 75% 以上; 黄冰艳等[ 22] 以 M S 培养基为 基础, 探讨了培养基中的有机营养成分( 除蔗糖外) 及光照在试管苗快繁中的作用。结果表明, 缺乏有 机营养成分( 除蔗糖外) 对试管苗生长无显著影响。 光照不仅影响试管苗的器官建成, 也影响试管苗的 生长, 光照时数以不低于 16h/ d 为宜。另外, 在简 化快繁培养基、降低培养成本方面, 研究了使用不含 有机物的 1/ 2M S 培养基和用食用白糖代替蔗糖、用 卡拉胶代替琼脂、用自来水代替蒸馏水、试管苗单叶 节或双叶节扦插快繁等多项简化措施, 使离体快繁 成本降低了近 80% 。
2009 年第 9 期
河南省甘薯脱毒技术研究现状及展望
张振臣
( 南省农业科学院 植物保护研究所, 河南 郑州 450002)
摘要: 简要总结了河南省近年来在甘薯脱毒及病毒检测技术研究方面取得的主要进展, 并对脱毒 甘薯的应用前景作了展望。 关键词: 甘薯; 病毒病; 脱毒技术; 研究现状 中图分类号: S515 文献标识码: A 文章编号: 1004- 3268( 2009) 09- 0064- 04
甘薯是我国重要的粮食作物之一, 同时也是新 型的能源植物[ 1, 2] 。甘薯单位面积的能量产量远高 于马铃薯、大豆、水稻、木薯、玉米, 约为玉米的 2~ 3 倍。2. 8~ 2. 9t 甘薯干可生产 1t 乙醇, 而生产同样 数量的乙醇需要玉米 3. 2t、小麦 3. 3t [ 2] 。因此, 甘 薯对保障我国的粮食安全与能源安全都将起到重要 作用。由于甘薯是无性繁殖作物, 一旦感染上病毒 病, 病毒就会在体内不断增殖、积累、代代相传, 使病 害逐代加重, 造成甘薯产量降低, 品质变劣和种性退 化, 对甘薯生产造成严重危害[ 3] 。据估计, 中国每年 因甘薯病毒病造成的损失高达 40 亿元[ 1, 3] 。甘薯病 毒病已成为影响甘薯生产的重要限制因素之一。由 于病毒对寄主植物的高度依赖性, 对于病毒病害目 前尚无特别有效的化学防治药剂。种植脱毒甘薯是 防治病毒病、提高甘薯产量、延长品种使用年限最有 效的方法之一。河南省从 1997 年起, 开始进行甘薯 脱毒技术研究, 10 多年来, 在甘薯病毒种类鉴定、病 毒检测、脱毒新品种培养以及生产应用等方面取得 了明显进展, 现总结如下。
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