重金属抗性微生物的筛选及其应用研究

重金属抗性微生物的筛选及其应用研究
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引言：重金属污染具有长期性，累积性，潜伏性和不可逆性等特点，危害大治
理成本高，我国在长期的矿产开采，加工以及工业化进程中累积形成的重金属污染近年来逐渐显现，污染事件呈多发态势，对生态环境和健康构成了严重威胁。

与传统的处理方法相比，其具有无二次污染、处理效率高、适应范围广、成本低等优点，在低浓度下，金属可被选择性地去除、分离回收。

随着生物技术的发展，20 世纪80 年代人们逐渐将低含量重金属污染治理的研究重点转向了微生物修复技术，该技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到人们的广泛关注。

一、重金属污染的微生物修复
1.1概述
重金属污染的微生物修复:利用微生物的生物活性对重金属的亲合吸附或转化为低毒产物，从而降低重金属的污染程度。

重金属不能被微生物降解并且对它们有毒害作用，但是许多重金属是生命必需的物质或元素，微生物对重金属又有一定的抗性和解毒作用，可以吸附和转化重金属，改变它们在土壤中的环境化学行为，从而达到生物修复的目的。

目前，研究比较多，在生产中得到应用主要是自养微生物，大部分是土著微生物。

土著微生物是有固定碳素的光合细菌、抑制病害的放线菌，分解糖类的酵母菌，在嫌气状态下有效分解的乳酸菌等群落。

已使用的应用有，将微生物制成微生物吸附剂去除水中重金属；生物通风工艺处理重金属污染的土壤；菌根真菌促进植物对重金属的吸收；也有的对微生物进行基因工程改造，以加强对重金属离子的吸附或代谢，但还停留在实验水平，有待进一步研究。

2.1微生物修复特点及优势
传统的处理重金属的物理化学方法很多，如化学沉淀法、离子交换法、电解法、反渗透法、萃取法、活性炭吸附法、膜分离法等，它们各有优缺点。

但是这些方法都不同程度地存在着投资大、能耗高、操作困难、易产生二次污染等缺点，特别是在处理低含量重金属污染时，其操作费用和原材料成本相对过高。

植物修复则对气候、PH、盐度等自然和人工条件有一定要求，并受病虫害影响，植物培养较困难且培养时间长。

另外，受植物根系限制，处于植物根系意外以外的污染物很难去除。

微生物跟动、植物相比,具有个体微小,比表面积大,繁殖快,代谢能力强繁殖快，种类多、分布广，遗传稳定性差,容易发生变异适应性强容易培养等特点。

此外，某些微生物的生物活性对重金属具有吸附、吸收、溶解、沉淀以及转化等
作用，降低土壤中重金属的污染程度。

重金属不能被微生物降解并且对其有伤害作用，但是微生物对重金属又有一定的抗性和解毒作用。

因此，只要恰当地利用微生物自身特点和其与重金属的相互作用，就可高效处理重金属污染的水体或土壤，并且对重金属的回收也有重大作用。

如：芽孢杆菌属的菌株由于其细胞壁表面存在一层很厚的、网状的肽聚糖结构，因此都有强大的吸附金属的能力。

而曲霉属的一些真菌菌株对多种重金属和放射性核素的吸附效果也很好。

微生物修复具有以下优点：
1.对环境影响小，几乎不引起二次污染；
2.投资较少，实施简单，运行费用低；
3.去除含极低浓度（1～100mg/L）重金属的废液效率高；
4.操作PH值及温度范围宽（PH=3～9，温度4～90℃）；
5.吸附速率高，选择性好，易回收；
6.如果采用酵母工业废弃菌丝制备的生物吸附剂，由于价格低廉，不必回收，
可直接采用煅烧法回收被吸附出的重金属；
二、现状：
国内
目前，我国用微生物的高效降解、转化能力在治理重金属污染方面已经取得了良好效果。

如肖伟等人从宝钢电镀污泥中分离得到一系列高六价铬抗性菌株能耐40mmol/L Cr6+。

但是，我国在微生物处理重金属这方面的研究尚处于起步阶段，需要加大微生物与重金属的作用机制和应用的研究。

国外
1.对微生物与重金属相互作用，尤其是其抗性机制的深入研究，为其应用提供了理论依据。

2.高效生物吸附剂的研发，使用死的微生物制成生物吸附剂去除水中的重金属，例如AMT-BIOCLAIM工艺就是利用死的芽孢杆菌制成球状生物吸附剂吸附水中的重金属离子。

3.大力应用微生物基因工程技术，将重金属与微生物中的肽结合，以增强微生物对重金属的吸附和耐性的。

如利用微生物外源表达金属硫蛋白（Metallothionein，MT）、植物螯合肽（Phy-tochelatin，PC）和谷光甘肽等其他一些小分子肽，或者同时表达金属离子结合蛋白和其他蛋白来同时增加微生物对重金属离子的吸附和转运。

4.对菌根真菌植物结合修复重金属污染的土壤有了一定的研究并取得相应成果。

如，Ricken等将紫花苜蓿和燕麦接种囊霉菌根真菌后Zn、Cd、Ni的含量增加。

5.加强重金属污染对微生物的毒理学研究，从研究壤重金属污染的毒理效应，
风险评价及其诊断指标的建立入手，建立相关环境质量指标体系。

总体上说, 目前对于微生物的重金属抗性及其机制的问题还缺少大规模的细致的定性研究, 国内外也未形成统一的抗性理论及标准, 但这些问题的提出与研究具有重大的理论与实践意义。

随着环境的进一步恶化, 微生物的长期适应或产生抗性, 必然存在抗性微生物的筛选及应用问题。

三、筛选
3.1微生物选择
筛选污染物高效降解菌株的研究是微生物修复技术研究的第 1 步。

根据微生物与污染物的作用机制，选择高效微生物的标准包括：①对污染物有较高的耐性；②对环境的适应性较强；③对污染物的降解效率高、专一性强；④不影响环境中原有的生物多样性。

修复重金属污染的微生物主要是土著真菌和细菌，不同微生物对重金属污染的耐性也不同，通常为“真菌>细菌>放线菌”。

真菌在自然界中分布很广，对环境适应能力强，在生物修复中得到广泛关注。

污染土壤中的土著微生物往往具有较高的重金属抗性从中分离的微生物由于适应当地的自然环境，所以能有效修复重金属污染。

因此，采用稀释平板分离法在矿区重金属污染土壤中分离、筛选耐重金属的微生物，研究重金属耐性，以期为重金属污染的治理及修复开辟一条高效的途径。

3.2筛选方案
3.2.1培养基制作
微生物从中吸取营养并赖以生存繁殖的介质称培养基。

可分为业液体和固体两种形式。

不同的微生物，培养基的制作方法也不同。

根据需要配制充分数量的马铃薯葡萄糖培养基（用于真菌的培养）和牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌的培养）。

马铃薯葡萄糖培养基的制作方法如下：200g马铃薯切块，加水煮烂（需沸腾20～30min）,用纱布过过滤加入20克葡萄糖，加蒸馏水至1000ml，自然PH，搅拌溶解；封装后放入压力蒸汽灭菌器中，在121℃温度下灭菌30min。

牛肉膏蛋白栋培养基制作方法:用新切到0.001g的电子天平称取牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g，依次将他们放入盛1000ml蒸馏水的锥形烧杯中加热溶解，调节PH＝7.4～7.6.宗庄荷放入压力蒸汽灭菌器中，在121℃的温度下，灭菌30min.
固体培养基是在上述培养基中再加上1.5%左右的琼脂和一定量的硅胶，冷却至常温即制成平板分离用的固体培养基。

3.2.2采样与分离培养
水体微生物采集:取50～250ml细口玻璃瓶，洗净并配好胶塞，用牛皮纸包好瓶口，置于121℃的烘箱灭菌20分钟，冷却后即可用作采集瓶。

带采集瓶到预先选定的水样中采样，并做好时间，地点等采样信息的标记。

要注意的是，水样不能装满，留一定空间存空气，取样后立即盖好瓶塞并用牛皮纸包好瓶口，带回实验室。

矿区土壤采样：使用无菌纸袋到预先选定的地方，采集数份的土壤，不同位置的样品分装到不同的塑料袋，并做好标记。

带回实验室，用合适大小的烧杯加入蒸馏水，搅拌溶解，静置沉淀，然后起上层清液。

将上面两类稀释10倍后涂布于普通培养基上,在28℃～35℃条件下，恒温摇床中培养(一般24小时以上)，待长出菌落后，使用接种环根据细菌、真菌形态、颜色等特征分别采用牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯葡萄糖培养基进行划线培养。

如此反复进行2～3次平板划线分离培养，即可获得纯菌株。

再将菌株接种到液体培养基中，以获得更多的该种菌株。

这些菌株一方面可用于下一步的抗性
检测；另一方面则用于冷冻保存，具体方法如下：使用仪液枪吸取500μml菌株液注射到1.5ml的离心管中，加入500μml的丙三醇并混合均匀。

将其盖紧并置于4000r/min的离心机中离心10分钟，取出放在-80℃的冰箱中冷冻保存。

3.2.3抗性检测
能抑制菌株完全不生长的培养基中金属离子的最低浓度为该金属的最低抑菌浓度，用来反映细菌对金属的抗性。

将重金属溶液加入液体培养基配制成Mn、Cd、Cr浓度分别为0mg/L,5mg/L,15mg/L,50mg/L的80mL培养基，然后将培养好的纯菌珠接种到培养基中，置于恒温培养箱中28℃培养,观察菌落生长情况,确定各金属离子的最低抑菌浓度，筛选出重金属抗性较强或具有其他优点的微生物。

3.3.4纯化及鉴定
为了以后的研究和应用，需要将重金属抗性强的微生物进一步纯化培养，保存，然后去鉴定其属于什么类型的微生物。

3.3.5驯化
修复微生物在使用之前要进行驯化，使之适应修复过程中可能对细菌不利的工艺条件或对细菌具有毒害作用的物质成分。

驯化的办法是逐渐变化不利因素强度之后对细菌进行转移培养，在训化过程中，那些对新环境不适应的细菌受到抑制和死亡，而某些活力较强的细菌会通过变异等途径演变成耐受性更强的细菌而活下来，形成对新环境具有耐性的菌株。

3.3.6预期结果
在经过上述筛选培养后可得到1～2种具有良好重金属抗性其他优点的微生物，作为较好试验材料应用于重金属污染的治理，为重金属污染的微生物筛选丰富了菌种来源，申请1～2个微生物专利。

3.3.7注意事项
无菌
无菌室微生物筛选成功的保障，主要包含以下几个方面：
1.培养基的高压灭菌；
2.使用仪器的灭菌处理；
3.操作环境的无菌，一般在洁净无菌工作台内操作；
标记和记录
从采样到筛选结束的整个实验过程中，标记和记录是必不可少的。

标记可采用一般标记方式，也可采用个人方式的标记。

但需要遵循简单、清楚、易区别的原则。

记录需包含时间，实验内容，实验现象及结果等必要信息，有的则需记录地点，如某份土壤是从某矿区植物根际采集而得。

保存
在微生物的晒选中保存菌种是非常重要的，主要是用来做后续的培养、研究和鉴
定工作。

四、应用
2.1微生物修复原理及应用
某些微生物能够产生胞外聚合物这些物质具有大量的阴离子基团，从而与重金属离子结合而解毒。

某些微生物能代谢产生柠檬酸、草酸等物质，这些代谢产物能与重金属产生鳌合或是形成草酸盐沉淀，从而减轻重金属的伤害。

另外，在重金属的胁迫下微生物能够通过自身的生命活动积极的改变环境中重金属的存在状态。

例如，微生物活动可改变土壤溶液的pH值，从而改变除氧对重金属的吸附特征来影响重金属的化学行为。

此外，微生物也可通过改善土壤的团粒结构、改良土壤的理化性质和影响植物根分泌等过程间接地影响重金属。

[重]。

总的来说，重金属微生物修复原理可分为以下三种。

微生物吸附
利用微生物化学成分和结构特性来吸附废水中的重金属离子, 通过固液两相分离达到去除废水中的重金属离子的目的。

例如曲霉属生物体预热处理后能有效地吸附金；聚氨基葡萄糖生物聚合体也可以有效地吸附各种金络合物等。

微生物吸附类型及其作用机制如下：
其一、利用微生物细胞直接固定金属离子。

在这方面，微生物表面结构对重金属的吸附起着重要的作用（其中细胞壁和粘液层能直接吸收或吸附重金属）。

微生物的表面既带正电荷，又带负电荷!大多数微生物所带的是阴离子型基团，特别是羰基，因此在水溶液中呈负电性!根据"#$%理论，带电的菌体粒子与固体靠近时，相互作用力（f）与作用势能(G)有如下的关系：
f(h)=-dG(h)dh （h为两表面间的距离）
因而微生物与重金属吸附只是一个自由能变化过程!不同的微生物因带电性不同、与重金属间的作用力及作用势能变化不同而对重金属的吸附作用有异!其中革兰氏阳性细菌往往能固定较多的金属离子。

其二，利用微生物的代谢产物固定金属离子。

微生物在其生长过程与环境因素相互作用时会释放出许多代谢产物（如H₂g及有机物等），它们能与金属反应从而固定重金属。

有迹象表明硫酸盐还原菌的代谢产物可作为氧化铅、氧化锑的硫化剂!典型的还有利用细菌产生的硫化氢固定金属，如硫弧菌（Desuifovibrio）和脱硫肠状菌（Desulfotomaculcum）；另外，许多微生物提取物也具有键合能力，例如Zoogloearamigera可产生很多胞外多糖，这种多糖由葡萄糖、半乳糖和丙酮酸等构成，具有很高的金属键合活性。

还有一些微生物（例如柠檬酸菌）利用某些细胞表面的HPO₄²﹣来固定金属。

利用微生物对重金属的吸附作用制成生物吸附剂。

利用微生物体系制备的生物吸附剂处理和回收废水中的重金属，是目前实践证明最有发展前途的一种新的重金属污染处理方法
微生物转化
微生物可通过多种渠道改变重金属的活动性，使重金属在其活动相与非活动相之间转化，从而影响重金属的生物有效性。

微生物对重金属的转化作用主要分为甲基化、还原作用、氧化作用3 类。

（1）甲基化
汞、砷、镉、铅等金属和类金属离子都能够在微生物的作用下发生甲
基化反应。

假单胞菌属在金属及类金属离子的甲基化作用中具有重要
的贡献，他们能够使许多金属和类金属离子发生甲基化反应，从而使
金属离子的活性和毒性降低，但是有机金属的轻脂性比金属更强，对
生物体的危害更加严重。

例如甲基汞的生物毒性比无机汞高50～100
倍。

另外，有的重金属甲基化产物具有挥发性，提高了金属的迁移和
扩散能力，小范围的重金属污染有一定的治理作用，但是会造成更大
范围的污染。

（2）氧化作用
微生物还能将环境中的一些重金属元素氧化，某些自养细菌如硫铁
铁杆菌类能氧化As³+、Cu²+、等，以降低这些金属离子的活性。

有
些微生物能够将毒性较大的Mn²+、Sn³+氧化为毒性较小的Mn4+、
Sn4+.
（3）还原作用
微生物还能够将高价金属离子还原成低价态，将有机态金属还原成
单质，有些金属在这个过程中毒性消失。

中科院微生物研究所的王保
军等用烟草头胞霉F2在含有200mg/L的Hg2Cl的液体培养基中生长
了10小时后，汞减少90％，之后菌量迅速增加，结果表明，氯化汞
能被还原成汞元素。

据分析，约有12%的光汞挥发到大气中，7%的汞
被菌体吸收，其余以的元素汞形式沉积在培养液底部。

微生物能够将高价金属离子还原成
微生物淋溶
微生物能够利用有效的营养和能源，通过分泌有机酸络合并溶解重金属，重金属离子的溶解主要是通过各种代谢活动直接或间接地进行。

微生物的代谢作用，能够产生多种低分子量的有机酸如甲酸，乙酸丙酸和丁酸等。

Chanmugathas 和Bollag等研究发现，在营养成分的条件下，微生物可以促进Cd的淋溶，从土壤中融解出来的Cd主要和低分子量的有机酸结和在一起。

利用微生物的淋溶可以从金属尾矿和难浸矿石中回收金属，如表面活性剂、乳化剂等。

2.2综合应用实例
近年来，微生物技术发展十分迅速。

尤其是应用微生物修复技术处理重金属污染方面，与传统处理重金属污染的方式相比，具有费用低、环保安全和效率高等优点，逐渐成了处理重金属污染的主要技术措施。

下面举几个实例，以便能更好地对微生物修复重金属的应用探究。

微生物生物膜法
通常生物膜被孤立在一个支撑物体上，而污水则流过这个支撑物体。

产生生物膜生物的混合物生长在支撑物上，并不断提供新的生物膜。

固定在旋转鼓状支撑物上的生物膜能富集流经它的废水中的金属，处理过的废水能安全排放。

生物膜可以是活的和无生命的。

例如色杆金属的一些中文的生物膜和生物量（无生命）都被用于从污水中回收镉、铅、铬、铜、锌。

使用活的生物膜时，生物膜很少需要更换，不过无生命的生物膜需要定期的更换，因为他们的去除率会随着时间而下降。

有的微生物，生物膜还被用于处理金属污染的海水，不过所用微生物是海
洋细菌，如迷人德莱氏菌。

同样的，是微生物生物膜也能用于去除生活污水中的金属。

在生活污水处理中，重要的生物膜形成生物是动胶菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属的一种。

书里还有朱水从污水处理厂排放前通过沉淀成从污水中去除络合金属。

湿地处理
湿地处理是一种费用——效益好，效率高的从污水（如酸矿水）中去除金属的方法。

金属浓度的降低通常高于90%。

湿地生物修复的机制包括：微生物对金属的吸附、金属的生物富集、细菌对金属的氧化和硫酸盐还原高。

由于等植物和藻类的生长造成湿地高含量的有机质，这又促进了硫酸还原微生物的生长和有机质对金属的吸附。

尽管有这么多各式各样的作用一起促进去除有毒金属，但金属不被破坏。

由于任何环境都可能对金属的去除起反作用，因此湿地要是受到不断地监控。

例如PH的下降，可能导致沉淀金属的溶解，对湿地沉积物的扰动可能会改变氧化还原条件，并导致还原态金属的氧化。

湿地是一个有弹性的系统，随着新植物的生长和有机质的输入，湿地能有效地在一段时间内，将重将金属去除。

沥滤
堆式沥滤通常是挖掘一条深约30厘米的狭长的沟并并沿沟铺上聚乙烯薄膜，空气管道也沿着沟平铺以提供好氧环境。

堆上堆积2～3米高的经过粉碎的矿石，然后用含有氧化亚铁硫杆菌接种物的酸化水（PH=2～3）饱和；沥滤液在底部收集并再循环到堆料。

与堆式沥滤类似的堆场沥滤是在一块不渗透的地面上进行的。

不过没有人工通气，因此运行费用较低，在这种情况下抽提的效率会明显降低。

桶式沥滤是对一个大槽中的矿泥作连续处理。

另外，矿石和含有氧化亚铁杆菌的酸化水混合。

这种方法优于堆式沥滤之处在于能够有效控制渗透的条件。

泥浆生物反应器
生物修复的条件在生物反应器中得到加强，驯化的微生物种群通常从前一个处理中再引入新的处理中增强起降解率。

处理结束后，材料通过一个水分离系统，水得到循环。

整个处理过程中反应条件得到严格控制，因此处理效果十分理想。

反应器的罐体一般为水平鼓形或升降机形，底部为三角锥形，一般的反应器有气体回收和循环装置。

为了减少罐体对污染物的吸附和增加耐磨性，反应器的主体一般采用不锈钢，小型反应器可采用玻璃为原料。

反应器的大小可根据实验的规模来确定。

反应器搅拌装置的作用是将水和土壤充分混合使土壤颗粒在反应器中处于悬浮状态，另外，也可以使添加的养物质、表面活性物质以及外接菌在反应器中与污染物充分接触而加速器降解。

泥浆生物反应器的处理条件可根据需要进行搅拌速率水土比、空气流速以及添加物质浓度的合理调控以增强其降解功能。

2.3总结
生物与重金属相互作用机制及其应用的研究已成为微生物学中的重要研究领域。

利用微生物产生的聚合物进行含金属废水的处理已有许多研究。

在应用固定化细胞处理废水和回收金属方面也已做了各种尝试。

利用工业发醉后刹余的菌体作为生物吸附剂,不仅能降低处理费用而且为以废治废开辟了新途径。

建立人工湿地,能充分利用自然界中的微生物与植物的协同净化作用,处理含金属废水及天然水源。

另外,由于微生物的特点及其与重金属的特殊关系。

他不仅运用在重金属污染的环境治理，而且被运用到了微生物采矿、重金属污染的环境评价。

当今科学技术的发展，尤其是基因工程技术、信息技术、以纳米技术为代表的材
料学的迅速发展，微生物修复技术应用提供了技术支持和更为宽广的道路。

不过，我们也应看到，在以上微生物修复技术处理重金属污染中，都不同程度存在或多或少的问题。

首先，该项技术应用的时间比较短，技术体系还不完善，需要较长时间的深入研究探索; 其次，很多微生物对人体具有一定的伤害或副作用，在利用其处理重金属污染的同时也要特别注意对有害微生物的防治; 第三，对于处理重金属污染具有高效作用的微生物的筛选及培养，是一个十分复杂过程，历时较长。

因此，应下大力气、高投入地开展微生物修复技术处理重金属污染的研究。

问题与展望
微生物处理重金属的研究进展虽然国际上对微生物处理重金属的研究取得了长足发展, 确认了微生物修复的应用前景。

然而, 有关微生物对重金属的吸附、转化机理还不是很明确。

此外, 该项技术尚处于实验室阶段, 大规模利用微生物处理重金属的情况还很少, 很多因素限制了它的大规模使用。

如环境中存在多种重金属, 如何将具有不同处理功能的高效菌株混合培养? 采用生物工程技术生产出的微生物是否能适应外部环境条件? 怎样将微生物修复技术与其它环境净化技术进行有效的组装、配套? 以及如何再生生物修复剂?随着分子生物技术和基因工程技术的迅速发展, 有待于从分子水平上去研究重金属对微生物的影响机制, 为进一步研究和运用微生物修复水体重金属污染提供更多的科学依据。

为了加速微生物处理重金属废水的工程应用, 今后有待于进一步加强以下方面的研究:( 1) 在已有的微生物吸附机理研究基础上，进一步探讨微生物吸附剂对重金属吸附的反应动力学和热力学特性，从而更深入地揭示微生物吸附规律( 2) 开发高性能、高选择性及具有理想粒度、机械强度的微生物吸附剂( 3) 。

通过筛选对重金属耐性强的微生物，并构建相应的基因工程库，使其形成系统，以提高处理污染的效率( 4) 开发新的高效固定化生物反应器、建立在微生物技术基础上的新的处理工艺, 最大限度的提高生物的效率。

（5）研究重金属污染的环境中植物根系与根际环境微生物类群的相互作用，筛选可供应用的耐重金属并促进植物生长的根际微生物，结合植物与根际微生物的应用，可望提供更为有效的金属污染的植物修复技术。