酵母菌生理生化试验

一、酵母菌糖发酵试验

（一）实验目的

了解鉴别酵母菌的实验方法。

（二）实验原理

酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。因此，这是鉴别酵母菌种类的一项重要依据。

酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫变黄）或溴麝香草酚蓝

（pH7.6-6.0由蓝变黄）指标剂颜色的改变来确定。产气可由发酵管气泡的产生予以证实。

（三）材料

糖发酵基础液（见附录I），1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚蓝溶液（见附III），葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖，啤酒酵母斜面菌种。

（四）实验内容

1、糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的1%加入糖，分装于杜氏发酵管中（培养液的高度约为4-5厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约0.4×2.0－2.5

厘米）一支。每种糖设三个重复管，121℃高压灭菌15分钟。

2、将啤酒酵母分别接入上述各发酵管中，置30℃下培养48-72小时，另以不接种者作对照。

3、如产酸则培养液pH值下降而变黄色；如产气，则必先产酸，并在杜氏小管顶端出现气泡。

4、结果记录。以“”表示产酸，“0”表示产气，“＋”表示产酸产气，“－”表示无变化，“碱”表示产碱。

二、酵母菌碳源同化试验

（一）实验目的

了解酵母菌对各种碳源的利用情况。

（二）实验原理

碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的50%，为酵母菌生命活动提供所需的能量和组成其结构的物质。酵母菌对各种碳源的利用，因种类不同而异。这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。

（三）材料

无碳基础培养基（见附录I），啤酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖溶液。

（四）实验内容

1、液体试管法

（1）每管加无碳基础培养基5毫升，加被测试的某种碳源，并以葡萄糖作为对照。

（2）接入啤酒酵母，28℃下培养1-2周，观察结果。

2、生长图谱法

（1）无碳培养基内加入2%的水洗琼脂，融化后冷却至45-50℃，到至平板。

（2）接种新鲜培养的啤酒酵母于1毫升无菌生理盐水内，搅匀后倒入上述未凝平板内，摇匀待凝。

（3）皿底用特种蜡笔写上被测试各种碳源的标记。

（4）用不锈钢匙，按标记加入相应的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作对照。

（5）28℃下培养24-48小时后观察结果。

3、结果观察

（1）液体试管中是否形成醭，环岛等。

（2）生长图谱中测量菌落大小，说明对碳源的利用情况。

三、酵母菌氮源同化试验

（一）实验目的

了解酵母菌对各种氮源的利用情况。

（二）实验原理

酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外，故酵母菌对复杂的蛋白质不能利用，酵母菌对一些较简单的含氮化合物的利用程度也不一致。

（三）材料

无氮基础培养基（见附录I），啤酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和尿素溶液。

（四）实验内容

1、液体试管法

方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白对照。

2、生长图谱法

方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白对照。

3、结果观察

（1）液体试管中溶液pH值的变化。

（2）生长图谱中测量形成菌落的大小，说明对各种氮源的利用情况。

四、酵母菌生长曲线的测定试验

（一）实验目的

掌握单细胞微生物群体生长曲线的几种测定方法。

（二）实验原理

酵母菌属于单细胞真核型微生物，把一定数量的酵母菌接种于的液体培养基中，在适宜的温度下培养时，它的生长过程具有一定的规律性。在其生长过程中，定时取样测定酵母菌细胞数量，然后以酵母菌细胞数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制所得的曲线叫生长曲线。此生长曲线大致可划分为四个阶段：调整期、对数生长期、稳定期和衰退期。

（三）材料

酵母菌增殖培养基（见附录I），啤酒酵母斜面菌种。

（四）实验内容

1、将培养24小时左右的啤酒酵母斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，以3000转/

分的速率离心，得菌体。将酵母菌体沉淀物再用无菌水洗2-3次后，制备啤酒酵母菌悬液（细胞数量约106左右/毫升），测数备用。

2、取上述菌悬液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培养液的试管中，25℃下培养，以此为起始时间，记录起始溶液的细胞数。并在培养1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小时时分别取样检测酵母菌细胞数量。

3、酵母菌细胞数量的检测

方法①：活菌计数法。此法是将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，取一定量体积（在0.1-1毫升之间）的稀释液涂布于盛有固体培养基的培养皿内，在25℃下培养24小时左右，计算培养皿内菌落数就可测出溶液中活菌数量。

方法②：血球计数板计数法。此法是先将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，使菌落数约为105-106个/毫升，取一滴稀释液滴于血球计数板内，在显微镜下直接计算细胞总数。

4、绘制生长曲线

以酵母菌细胞数的对数作为纵坐标，以培养时间作为横坐标，画出酵母菌的生长曲线。并分析酵母菌群体的生长规律。