支原体检测PCR方法

PCR法检测支原体

实验原理：

通过对支原体特定的序列设计引物，当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增，会将目标DNA特异性的复制，然后通过琼脂糖电泳观检测，会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时，由于没有模板，PCR无法扩增，则琼脂糖电泳跑不出条带，出现阴性结果，为确保PCR法的精确性，故需要找到最优的PCR条件在进行检测。

实验目的：

检测培养的细胞是否有支原体污染。

实验材料：

0.5 ml EP管；PCR管；镊子；手套；口罩；EP管架；移液枪（100 ul，10 ul）及配套枪头(黄、白)；dd H2O；上下游引物（两组）；dNTPs；10 x Buffer；Easy Taq；冰盒；琼脂糖；锥形瓶（200ml）；量筒（50ml）；全套琼脂糖电泳设备（电泳槽，制胶槽，梳子，电源输出）；凝胶成像系统；

PCR引物：

LZY-5 Myco universal F：GGGGAATGGGTGAGTAACACG

LZY-5 Myco universal R：CGGATAACGCTTGCGACCTATG

产物大小：500bp

LZY-6 mycotest F ：GGGAGCAAACAGGATTAGTATCCCT

LZY-6 mycotest R ：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC

产物大小：250bp

实验步骤：

1、取样：

直接取培养细胞的培养基上清。

2、PCR（为25ul体系）

1、配制反应体系，根据检测样本数+1个阴性对照（水）+1个阳性对照，算出PCR 样本的个数，在此基础上增加几管的量，把除检测培养基外的其他组分按计算好的量加到一起，混匀后分装，最后加入检测培养基。

5#引物：LZY-5 Myco universal

反应体系反应条件

检测培养基 1 ul 94 ℃ 3 min

LZY-5 -F 0.5 ul 94 ℃30 s

LZY-5 -R 0.5 ul 55℃30 s

10xBuffer 2.5 ul 72 ℃30s

dNTP 0.5 ul 25 cycles或30 cycles Easy Taq 0.5 ul 72 ℃10min

ddH2O 19.5 ul

6#引物：LZY-6 mycotest

反应体系反应条件

培养基 1 ul 94 ℃ 3 min

LZY-5 -F 0.5 ul 94 ℃30 s

LZY-5 -R 0.5 ul 51℃30 s

10xBuffer 2.5 ul 72 ℃20s

dNTP 0.5 ul 35 cycles

Easy Taq 0.5 ul 72 ℃5min

ddH2O 19.5 ul

3.琼脂糖凝胶的制备

1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

上图为两对引物梯度PCR的结果，5#引物选择：55℃（55.9℃），6#引物引物选择：51℃