脑微血管内皮细胞与体外培养神经干细胞共培养后Th1Th2相关细胞因子的表达

脑微血管内皮细胞与体外培养神经干细胞共培养后Th1/Th2相关细胞因子的表达
罗文芳
1
唐涛黎杏群林源罗杰坤钟鹏程刘清娥
（中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南
长沙410008）
〔摘
要〕目的
体外观察脑微血管内皮细胞（MVECs ）对来自大鼠海马神经干细胞（NSCs ）免疫相关细胞因子表达的影响。

方法
采用Tran-
swell 建立神经干细胞与脑微血管内皮细胞共培养模型（NSCs +MVECs ），用荧光免疫化学和RT-PCR 测定NSCs 中与Th1相关的IFN-γ、IL-2及与Th2相关的IL-4、IL-10的表达。

结果两种细胞共培养后，神经干细胞呈INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10阳性；同时INF-γ、IL-2mRNA 的表达上调，而IL-4、IL-10mRNA 的表达下调，与空白对照组比较明显差异（P ＜0.01）。

结论
脑微血管内皮细胞（MVECs ）有可能使神经干细胞的INF-γ、
IL-2表达上调，IL-4、IL-10的表达下调。

〔关键词〕脑微血管内皮细胞；神经干细胞；Th1细胞因子；Th2细胞因子〔中图分类号〕R743.34
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0512-05；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.034
The expressions of Th1/Th2related cytokines after co-cultured microvascular endothelial cells with neural stem cells in vitro LUO Wen-Fang ，TANG Tao ，LI Xing-Qun ，et al .
TCM Research Insitute of Xiangya Hospital Central-South University ，Changsha 410008，Hunan ，China
【Abstract 】Objective To investigate microvascular endothelial cells （MVECs ）on the expressions of IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10of NSCs in vitro.Methods Rat neural stem cells （NSCs ）aged 3 5day were adopted for amplification in vitro ，and co-cultured microvascular endothelial cells with neural stem cells.After 48h ，the expressions of IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10were assayed by immunohistochemistry and RT-PCR.Results After 48h of co-cultured ，the NSCs was positive of expressions in cytokines INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10；and the expres-sions of INF-γ，IL-2were increased ，the expressions of IL-4，IL-10were deceased （P ＜0.01）.Conclusions MVECs maybe up-regulate the expressions of IFN-γ，IL-2and down-regulate the expressions of IL-4，IL-10of NSCs.【Key words 】Microvascular endothelial cells （MVECs ）；Neural stem cells ；Th1cytokines ；Th2cytokines
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30472264）1
南华大学附属第一医院中医科
通讯作者：黎杏群（1933-），女，教授，主要从事中西医结合脑血管病及
肿瘤病研究。

第一作者：罗文芳（1980-），男，硕士，主要从事中西医结合脑血管病及
肿瘤病研究。

Th 细胞是决定移植免疫排斥的关键成分，Th1细胞产生IFN-γ和IL-2介导细胞免疫；Th2细胞则产生IL-4、IL-10等，介导体液免疫。

针对同种异体抗原的移植免疫应答主要是由Th1细胞介导。

研究发现，在移植器官功能发生障碍之前，常检测到IFN-γ、
IL-2基因表达增高〔1〕。

侧脑室的脑室下带（Svz ）和海
马的颗粒下带（SGz ）集中于血管周围，而且和内皮细胞间仅隔一层基板，这种解剖上的毗邻关系暗示了NScs 和内皮细胞间存在密切的联系。

本实验模拟内皮细胞与神经干细胞的体内环境建立共培养模型，观察Th1/Th2细胞相关细胞因子的变化，探讨同种异体内皮细胞与神经干细胞的免疫反应关系。

1材料与方法1.1材料1.1.1
实验动物
新生3d 的Sprague-Dawley 乳鼠6只，新生
7 10d Sprague-Dawley 乳鼠20只，雌雄不拘，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。

1.1.2主要试剂及药物M199干粉培养基、D-Hank's 液干粉
（Hyclone ），谷氨酰胺（上海伯奥），肝素钠、明胶、台盼蓝、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（Sigma ），胎牛血清（杭州四季青），DNase Ⅰ（Roche ），多聚赖氨酸（武汉博士德），bFGF 、EGF （Pepro Tech EC ），抗Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体（美国PharMingen ），Trizo1试剂盒、DNA Marker 、逆转录（RT ）试剂盒、Pre Mix Taq （宝生物大连），β-actin 引物（上海生工），一抗（Abcam ），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 、辣根酶标记链霉亲和素、浓缩DAB 试剂盒（北京中山），其他常用试剂为国产分析纯产品。

1.1.3
主要仪器
OLYMPUS IXTO 倒置显微镜（日本OLYM-PUS ），QWJ300TVBB 型CO 2培养箱（美国产），Sanyo 超低温冰箱（日本三洋），ELX800酶标仪（美国产），超净工作台（苏州净化），
E260电子天平（梅特勒），Beckman J2-21型低温离心机（美国产），Beckman DU-640紫外分光光度计（美国产），Nikon 倒置荧光相差显微镜（日本尼康），
PCR 仪（美国ABI ），DDY 多导电泳仪（北京六一），
UPW-5超纯水仪（美国产），DHW-60恒温水浴箱、DHP-81恒温箱（上海医用仪器厂），50ml 培养瓶、培养板、滤器等耗材（Costar 、Millipore 等公司）。

1.2方法
1.2.1
血管内皮细胞培养液的配制
用超纯水溶解M199干
粉培养基，配制成体积比为1ʒ1的M199无血清培养基（每1000ml 培基中另加2.2g 碳酸氢钠、1g 葡萄糖、0.9g 谷氨酰
胺），0.22μm滤膜过滤除菌，4ħ保存备用。

使用前加EGF、bFGF各20ng/ml，青霉素、链霉素各100U/ml，ECGS 500μg/ml，20%胎牛血清配成内皮细胞完全培养液。

1.2.2大鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离、培养、传代及鉴定新生7 10d SD乳鼠20只，75%酒精浸泡消毒5min，断颈处死，无菌条件下取脑，立即放入盛有4ħD-Hank's液的平皿中；仔细剔除大血管、软脑膜、脑干、小脑及大脑髓质，将大脑皮质剪成1mm3的小块，加入20ml含0.005%的DNaseⅠ的D-Hank's液，玻璃匀浆器上下匀浆20次；匀浆液用孔径150μm 的不锈钢滤网过滤，收集滤液，再用孔径75μm的不锈钢滤网，弃滤液；用D-Hank's液冲洗滤网，收集滤网上的微血管段，1000r/minˑ15min离心，收集沉淀的微血管段。

上述操作均在冰上进行。

将微血管段移入含0.005%DNaseⅠ的0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中，37ħ振荡消化30min；加入20%胎牛血清终止消化，1000r/minˑ15min离心，弃上清后，加D-Hank's液清洗，1000r/minˑ15min离心，弃上清，洗涤2次，沉淀物加入内皮细胞完全培养液，制成细胞悬液，接种于预先包被好明胶的玻璃培养瓶中，置37ħ、5%CO2培养箱中培养2h后，将细胞悬液转入一次性培养瓶中继续培养，每2 3d换液，观察细胞生长情况。

原代培养7 10d后，细胞呈单层密集生长，近亚融合时进行传代繁殖。

倒掉培养液后，以D-Hank's液清洗2遍。

0.25%胰蛋白酶37ħ消化细胞约5min，予20%胎牛血清终止消化。

800r/minˑ10min离心，吸出消化液，D-Hank's液清洗，离心，洗涤两次，收集内皮细胞，制成细胞悬液，接种于培养瓶中，以后每2 3d换液一次至细胞铺满瓶底。

将细胞以2ˑ105/ml细胞接种于预先放有洗净、多聚赖氨酸溶液包被并消毒的小盖玻片的24孔培养板中，培养基为内皮细胞完全培养液，培养2d后，用Ⅷ因子相关抗原进行免疫细胞化学鉴定。

1.2.3大鼠脑皮质微血管内皮细胞的鉴定Ⅷ因子相关抗原的免疫细胞化学检测：将洗净、多聚赖氨酸溶液包被、消毒后的小盖玻片置于24孔板中，按传代培养的方法，以密度为2ˑ105/ml接种细胞3d后，可见盖玻片上长有一层细胞，0.01mol/L PBS洗涤5minˑ3次，每孔加入4%多聚甲醛室温固定30min；按SABC试剂盒说明书进行操作，阴性对照用
0.01mol/L PBS代替一抗进行。

1.2.4测定细胞生长曲线收集生长良好的细胞，经胰酶消化，台盼蓝计数，以2ˑ105/ml细胞密度接种于一次性24孔培养板中置37ħ、5%CO2培养箱中培养，每日消化3孔，以血细胞计数板计数，取3孔细胞数均值绘制细胞生长曲线。

1.2.5海马NSCs的分离、培养、传代及鉴定〔2，3〕取新生（3d）SD大鼠，断颈处死，以75%酒精浸泡5min，无菌条件下取出大脑放入含无菌0.01mol/L PBS培养皿中，剥除脑膜，分离出海马，将其剪成0.5mmˑ0.5mm大小的组织块，移入10ml玻璃培养瓶内，加入0.05%胰酶-EDTA消化15 30min，20%胎牛血清终止消化，过200目细胞筛，收集细胞悬液于试管中，离心1000r/minˑ10min，D-Hank's液洗涤3遍，加入NSCs选择培养液，吸管反复吹打制成单细胞悬液，调整细胞密度，按1ˑ105个/ml接种于培养瓶，常规37ħ5%CO2孵箱中培养。

每3d半量换液，待原代克隆形成后（约7 10d），以0.25%胰酶消化细胞克隆制成单细胞悬液进行传代。

选取部分培养的细胞克隆种植明胶包被的24孔培养板上，加入含血清培养基DMEM/F12。

2d后以Nestin抗原进行免疫组织化学染色鉴定NSCs。

1.2.6NSCs+MVEC共培养脑微血管内皮细胞以1ˑ105/cm2的密度，种于包被2.5%明胶的OSTAR24孔TRAN-SWELL外槽，以脑微血管内皮细胞培养液培养72 96h后，细胞汇片；D-Hank's液洗细胞2次，在膜孔径8.0μm的内槽种入传代4d的神经干细胞球，分为共培养组（NSCs+MVECs）、空白对照组（NSCs），培养48h后，用荧光免疫细胞化学和RT-PCR 技术检测神经干细胞中INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10的表达。

1.2.7免疫细胞荧光化学检测INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10蛋白表达将洗净、多聚赖氨酸溶液包被、消毒后的小盖玻片置于24孔板中，按传代培养的方法，以密度为2ˑ105/cm2接种细胞3d，盖玻片上长有一层细胞后。

分空白对照组、共培养组加以处理；每组设6个复孔，按上述条件干预各组细胞后，吸出培养液，按SABC试剂盒说明书进行操作。

以上操作除滴加封闭液后勿洗外，其他各步骤间均需用0.01mol/L PBS洗涤5minˑ3次。

阴性对照用0.01mol/L PBS 代替一抗进行。

所有在同一条件下完成免疫组化染色的两组细胞，按每组6孔、每孔于400倍光镜下中随机选取一个高倍视野拍照。

1.2.8RT-PCR检测INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10mRNA收集各组细胞，按下述流程提取细胞总RNA。

①取1ml内含106个细胞的培养液于1.5ml EP管中；②4ħ，12000r/min离心30s，弃上清；③加入1ml Trizol，重悬细胞，室温孵育5min；④加入0.2ml氯仿，振摇15s，室温孵育10min；⑤4ħ，12000r/min 离心15min，收集上层无色水相于1.5ml EP管中，去沉淀；加入等体积的异丙醇，混匀，室温孵育5 10min；⑥4ħ，12000r/min离心10min，弃上清；加入1ml75%乙醇并混匀；
⑦4ħ，12000r/min离心10min，弃上清；空气中干燥10min；
⑧加入20μl含1ɢDEPC蒸馏水溶解RNA，取2μl RNA作凝胶电泳鉴定，确定RNA有无降解；再取1.5μl100倍稀释，分光光度计测定A260和A280值，以测定RNA的含量及纯度。

余液于－70ħ冰箱保存。

逆转录：取总RNA0.5μg，Oligo（dT）18（50μg/ml）引物1μl，RNasin1μl，加DEPC水至11μl，70ħ变性5min，在冰浴下加5ˑ逆转录缓冲液4μl，10mmol dNTP2μl，RNasin1μl，加DEPC水至19μl；37ħ，5min；加M-MLV1μl（200U/μl），总体积20μl；42ħ，60min后；再70ħ，10min。

PCR特异性引物用primer premier5.0软件设计，由上海生物工程公司合成，各引物序列见表1。

扩增反应体系：取Pre Mix Taq12.5μl，cDNA2.0μl，10μmol/L目的引物1.0μl，β-actin引物1.0μl加DEPC水至总体积25μl，4000r/min短暂离心后，于PCR仪中扩增。

反应条件：预变性94ħ，5min；变性94ħ，30s；退火温度见表1，
·
315
·
罗文芳等脑微血管内皮细胞与体外培养神经干细胞共培养后Th1/Th2相关细胞因子的表达第3期
40s ；延伸72ħ，45s ；35个循环，末次循环后72ħ延伸7min 。

取PCR 产物5μl ，加上样缓冲液1μl ，2.0%琼脂糖凝胶电泳，图像分析仪摄片。

采用Band Leader 软件分析数据，获得各电泳条带的吸光度值（X ），用β-actin 的吸光度值（A ）作为内参照，计算基因的相对表达量（X /A ）。

1.3
统计学方法
应用SPSS13.0软件，各组数据以x ʃs 表
示，两样本均数比较用t 检验。

表1
基因扩增引物序列、退火温度及产物大小
基因
引物序列（5'-3'）退火温度（ħ）产物大小（bp ）
IL-2正义：CATGTACAGCATGCAGCTCGCATCC
反义：CCACCACAGTTGCTGGCTCATCATC 64.2410IL-4正义：ATGCACCGAGATGTTTGTACC 反义：ATGCACCGAGATGTTTGTACC 55217IL-10
正义：TGCCTTCAGTCAAGTGAAGAC 反义：AAACTCATTCATGGCCTTGTA
62.2346IFN-γ正义：GTCATCGAATCGCACCTGATCAC
反义：CCGATGTATAGACATTCCTCTGG
60605β-actin 正义：CAGCCTTCCTTCCTGGGTAT 反义：TAGAGCCACCAATCCACACA
－
500
2结果
2.1
大鼠脑微血管内皮细胞分离培养及鉴定
倒置显微镜下
观察分离出的微血管段呈单枝或分枝状，长约200 800μm ，直径约20 30μm ；经胶原酶消化后，微血管管壁模糊不清；3d 换液清除组织碎片和红细胞后，可见散在贴壁的梭形内皮细胞，
排列不规则，核淡，胞膜明显。

5d 时细胞呈细长弯曲状，7 9d 传代后经兔抗Ⅷ因子相关抗原抗体免疫细胞化学染色，胞质可见明显的棕黄色着色，阴性对照无着色。

符合Ⅷ因子相关抗原的分布特点，证实培养的细胞为血管内皮细胞。

见图1。

2.2
大鼠脑微血管内皮细胞生长曲线
细胞计数后，以细胞
数及培养时间绘制细胞生长曲线。

可见细胞在前2d 生长缓慢，第3天起迅速增长，6d 后生长减慢。

由此选择传代后3 5d 进行共培养实验。

见图2。

2.3海马成体神经干细胞的分离培养与鉴定海马分离的细
胞接种到无血清培养基上，
2d 后大部分细胞死亡，10%细胞贴壁，其后形成2 4个细胞团，10d 后长出大小不一的细胞团，即神经球（neurosphere ）（图3），这些细胞球呈悬浮状，形态规则，细胞免疫荧光化学发光法检测均为Nestin 抗原阳性（图4），可证明为神经干细胞。

将上述细胞克隆经胰酶消化吹打制成单细胞悬液进行传代培养，
2 4d 后单个细胞又可重新形成克隆球（图5），并表达Nestin 抗原。

每次传代后，均有少量细胞贴壁分化，而且随传代的次数增多，贴壁的细胞也有增多的趋势，在7 8代左右还不影响细胞的传代，而后分化加剧，大部分贴壁分化。

图1
倒置显微镜观察脑微血管内皮细胞（ˑ150
）
图2
大鼠脑微血管内皮细胞生长曲线
图3培养10d 后的神经球（ˑ200）图4神经干细胞Nestin 荧光染色（ˑ300）图5继续传代培养中的神经球（ˑ100）
2.4
免疫荧光细胞化学观察脑微血管内皮细胞与神经干细
胞共培养48h 后，经免疫荧光细胞化学方法检测，神经干细胞
球IFN-γ（图6A 、图6B ），IL-2（图6C 、图6D ），IL-4（图6E 、图6F ），IL-10（图6G 、图6H ）均成阳性。

见图6。

·415·中国老年学杂志2012年2月第32
卷
图6
神经干细胞球免疫荧光表达（ˑ200）
2.5
RT-PCR 检测
RT-PCR 检测共培养神经干细胞中细胞因
子mRNA 表达，共培养神经干细胞中IL-2、INF-γmRNA 的表达上调，IL-4、IL-10mRNA 的表达下调，与空白对照组比较差异显著（P ＜0.01）。

见图7。

图7共培养神经干细胞中细胞因子mRNA 表达
3
讨
论
机体在正常状态时Th1和Th2细胞功能处于动态平衡，当机体因识别自体或异体抗原而发生免疫应答时，一旦反应向着Th1/Th2二者其中某一方向分化，则相应亚群通过自分泌方式增强其作用（正反馈），同时以旁分泌方式抑制向对方的分化。

在移植免疫应答中，一般认为Th1参与同种移植的急性排斥反应，
Th1细胞因子和排斥反应相关；而Th2细胞在同种移植中易于诱导移植耐受。

免疫应答中的一个重要过程是抗原提呈，即抗原提呈细胞（APC ）通过捕捉和处理抗原，并以MHC 分子限制形式提呈免疫活性细胞，
导致后者激活产生免疫效应。

移植排斥反应的关键是供、受体MHC 不相容，MHC 主要分为MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子，
Mason 等〔4〕
认为MHC-Ⅱ类抗原在诱导同种移植免疫排斥反应中起关键作用。

无论是异种还是同种异体脑内移植均可存在免疫排斥反应，可能主要与MHC Ⅱ类分子有关，是由MHC Ⅱ类抗原不同而诱发的
〔5〕。

神经干细胞是一种来源于神经组织或可向神经元和神经胶质细胞分化的前体细胞，很少表达MHC 抗原，故一直认为神经干细胞具有极低或无免疫原性，是一种比较“纯净”的细胞
群，同时缺乏APC 细胞（如内皮细胞或小胶质细胞），虽然早期的NSCs 无MHC 表达，但随着体外传代次数增加，细胞表面开始表达MHC Ⅱ类分子
〔6〕。

侧脑室的脑室下带（Svz ）和海马的颗
粒下带（SGz ），集中于血管周围，而且和内皮细胞间仅隔一层基板，
这种解剖上的毗邻关系暗示了NScs 和内皮细胞间存在密切的联系，在异基因神经干细胞移植治疗时血管内皮细胞可作APC ，据此推测异基因神经干细胞移植治疗脑出血可能会发生免疫排斥反应，神经干细胞不易存活，移植手术失败。

本实验采用Transwell 建立神经干细胞与脑微血管内皮细胞共培养模型，用荧光免疫化学和RT-PCR 测定NSCs 中与Th1相关的IFN-γ、IL-2，与Th2相关的IL-4、IL-10的表达，结果显示两种细胞共培养后，神经干细胞呈INF-γ，IL-2，IL-4，IL-10阳性；并且与空白对照组比较，共培养组IL-2，INF-γmRNA 的表达上调，
IL-4，IL-10mRNA 的表达下调。

IL-2、IFN-γ和IL-4、IL-10分别是Th1与Th2细胞所分泌的代表性的细胞因子，在Th1/Th2分化偏移过程中发挥着独特作用。

Th0向Th1/Th2分化的关键事件，是IL-12受体β链第二个亚单（IL-12R β2）的表达，以及由IL-12R β2受体启动的信号传导。

IL-12R β2的表达受IFN-γ和IL-4的正负调节。

IFN-γ与IL-4、IL-10能分别促进Th1和Th2的分化并抑制对方的表达
〔7〕。

因此，若能增强IL-4、IL-10的表达，或抑制IFN-γ的作
用，就可以上调Th1、下调Th2表达，而有助于移植耐受的形成。

CD4+Th 细胞不同亚群在移植免疫中通过其分泌的细胞因子各自发挥着独特作用：Th1细胞分泌的IFN-γ、IL-2等参与介导移植排斥反应
〔8〕
；Th2细胞分泌的IL-4、IL-10等则抑制
CD +
4
Th 细胞向Th1细胞分化，易于诱导移植耐受〔9〕。

因此，定
向调控Th 细胞分化，成为诱导移植免疫耐受的策略之一。

NSCs 具有无限增殖和多分化潜能。

NSCs 移植治疗脑出血，促进缺失的神经功能恢复具有巨大临床应用前景。

因此，定向调控Th 细胞亚群分化，即阻断Th1细胞及其所分泌的细胞因子的效应，或增强Th2细胞及其所分泌的细胞因子的效应已成为诱导移植免疫耐受的策略之一。

·
515·罗文芳等脑微血管内皮细胞与体外培养神经干细胞共培养后Th1/Th2相关细胞因子的表达第3期
4
参考文献
1
Svenvika M ，Ekerfelt C.Increased IFN-γresponse to transplantation anti-gens measured by cytokine MLC ：indications for a bi-phasic response pat-tern 〔J 〕.Transplant Immunol ，2003；11：101-5.
2刘柏炎，黎杏群，张花先，等.海马神经干细胞的分离、培养与鉴定〔J 〕.中国现代医学杂志，2002；12（19）：21-3.
3罗文芳，黎杏群.神经干细胞移植治疗脑出血大鼠的时间窗研究〔J 〕.中国老年学杂志，2008；28（7）：625-8.
4
Mason DW ，Charlton HM ，Jones AJ ，et al .The fate of allogeneic and xeno-geneic neuronal tissue transp lanted into the third ventricle of rodents 〔J 〕.Neuroscience ，1986；19：685-94.
5Barker RA ，Ratcli EL ，MaclaughlinM ，et al .A role for complement in the rejection of porcine ventral mesencephalic xenografts in a rat model of Parkinson's disease 〔J 〕.Neuroscience ，2000；20：3415-24.
6尹
岚，高赛里，李
莹.胚胎大鼠神经干细胞表面移植抗原的表达
及调控研究
〔J 〕.中国神经科学杂志，2003；19：177.7周光炎.免疫学原理〔M 〕.上海：上海科学技术文献出版社，2000：155，198，300-4.
8
Obataa F ，Yoshidab K ，Ohkuboc M ，et al .Contribution of CD4+and CD8+T cells and interferon-gamma to the progress of chronic rejection of kidney allografts ：the Th1response mediates both acute and chronic rejec-tion 〔J 〕.Transplant Immunol ，2005；14：21-4.9
He XY ，Verma N ，Chen J ，et al .IL-5prolongs allograft survival by down-regulating IL-2and IFN-gamma cytokines 〔J 〕.Transplant Proc ，2001；33：703.
〔2010-10-19收稿2011-02-15修回〕
（编辑曲莉）
新冠心苏合活血方对大鼠离体心房肌张力和心搏频率的影响
李春香
丁里玉
1
丁芳
2
王亮
2
朱晓卉（河北医科大学中医学院，河北石家庄050091）
〔摘
要〕目的
观察新冠心苏合活血方（简称活血方）不同浓度对大鼠离体心房肌张力和心搏频率的影响。

方法
取成年SD 大鼠30只，断
头处死后，迅速打开胸腔摘取心脏，分离并截取相连的左右心房，标本悬挂于95%氧气和5%二氧化碳饱和的Krebs-Henseleit 液的浴槽中，其下端固定，上端连接张力换能器并施加一定的静息张力（0.5g ），用超级恒温槽水浴循环维持在34.5 35.5摄氏度左右，待心房可恢复自主跳动并平稳后开始进行实验；利用MS4000U-1C 生物信号定量记录分析系统采集不同浓度的新冠心苏合活血方对大鼠离体心房肌张力和心搏频率的影响。

结果活血方有降低大鼠离体心房肌张力和减慢心房心搏频率作用；其中200 250mg /L 浓度范围作用更明显（P ＜0.05，P ＜0.01）。

结论活血方对SD
大鼠离体心房肌张力和心搏频率有负性变力和负性频率作用。

〔关键词〕新冠心苏合活血方；浓度；离体心房；心房肌张力；心搏频率〔中图分类号〕R285
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0516-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.035
Effect of new GuanxinSuhe Huoxue compound on muscle tension and cardiac frequency of vitro cardiac atrium in rats
LI Chun-Xiang ，DING Li-Yu ，DING Fang ，et al .
Traditional Chinese Medicine College ，Hebei Medical University ，Shijiazhuang 050091，Hebei ，China
〔Abstract 〕Objective To observe the effect of new GuanxinSuhe Huoxue compound on vitro cardiac atrium of rats'muscle tension and cardiac frequency.Methods Adult 30SD rats were selected ，the hearts were taken from thoracic cavity quickly after decapitation of rats.The cardiac atriums were isolated from the hearts.They were hanged on Krebs-Henseleit which was filled with 95%oxygen and 5%carbon diox-ide.The inferior extremity was fixed and the superior extremity was linked with tonotransducer by static tension of 0.5g.The device was kept from 34.5ħto 35.5ħ.Experiment was started when the cardiac atriums restored the independent beating.MS4000U-1C biological signal and
quantitative records analysis system were used to detected the muscle tension and cardiac frequency.Results The compound had obvious drop-ping effect on the muscle tension and cardiac frequency of vitro cardiac atrium especially the concentration of 200 250mg /L （P ＜0.05，P ＜0.01）.Conclusions New GuanxinSuhe Huoxue compound has the negative muscle tension and cardiac frequency on SD rats.
〔Key words 〕New GuanxinSuhe Huoxue Compound ；Concentration ；Vitro Cardiac Atrium ；Muscle Tension of Atrium ；Cardiac frequency
基金项目：河北省科技厅科技攻关项目（052061134D-15）1
河北医科大学药学院2
河北省第三医院
通讯作者：丁里玉（1954-），男，教授，硕士生导师，主要从事药品质量检验和药物临床实验研究。

第一作者：李春香（1954-），女，教授，博士生导师，主要从事中药教学、
科研及临床实验研究。

冠心病心绞痛是因冠状动脉供血不足，心肌急剧而暂时的缺血缺氧引起的临床症候，属中医“胸痹”范畴。

中医多认为本
病是由寒凝、气滞、血瘀等痹阻心脉所致，故采用散寒、行气、活血治疗方法，选用苏合香、冰片、乳香等组成新冠心苏合活血方，以奏开窍行气，活血止痛之功，主要用于冠心病心绞痛的治
疗。

新冠心苏合活血方（简称活血方）前期分别对异丙肾上腺素/垂体后叶素所致大鼠/小鼠急性心肌缺血进行了相关实验，其结果显示，该方对心肌缺血有较好的改善作用，其机制与抑制自由基的脂质过氧化，
保护和改善血管功能，舒张冠脉等有关。

为进一步探讨该方对实验性大鼠心功能的改善作用，故本实验主要观察该方对大鼠离体心房肌张力和心搏频率的影响。

·615·中国老年学杂志2012年2月第32卷。