淀粉酶固定化实验方案

实验三、α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

一、实验背景：

酶：生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。

在21世纪，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域：

·果汁制作（果胶酶分解细胞壁，促进果汁生成。）

·加酶洗衣粉（某些酶对污渍的作用一般碱性物质更大）

·根据体内酶活性变化检测疾病（淀粉酶的活性大小可体现胰脏、肾脏的功能）

固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

固定化酶载体应具备以下要求大体上有：

1) 在酶催化反应过程的惰性：载体应不与底物、产物及介质发生反应。

2) 有良好的渗透性：制备成柱子后，能使底物和产物能快速通过减少吸附。

3) 有生物亲和性和相容性，有利于酶活力发挥和稳定。

4) 有较高酶负载量，载体表面能提供多个活性位点利于酶分子偶联。

二、实验原理：

一般酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。

1、一般酶固定化的传统：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。

吸附法

利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

包埋法

包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，酶生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。

结合法

酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，

反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。

交联法

依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：( 1) 单独与酶作用；( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，最常用的是戊二醛，其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活。

各类固定化方法的特点比较:

2、淀粉酶催化反应：

淀粉酶：淀粉酶是指一类能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷键的酶之总称。

淀粉酶包括：α—淀粉酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、麦芽寡糖生成酶等水解酶类和葡萄糖苷转移酶、环状糊精葡萄糖苷转移酶等。

α—淀粉酶是一种内切酶，它随机地从分子内部切开α—1．4糖苷键(水解中间的α—1．4

键比分子末端的α—1．4键概率大)，遇到分支点的α—1．6键不能切，但能跨越分支点而切开内部的α—1．4糖苷键，由于产物的还原性末端葡萄糖残基上的C1碳原子呈α—构型(光学)，故称这种酶为α—淀粉酶。

α—淀粉酶的水解反应：淀粉在α—淀粉酶的作用下很快被切割成分子较小的糊精、低聚糖、麦芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降，对碘呈色反应为篮－紫－红－无色，又叫液化酶。

α—淀粉酶的水解产物：水解直链淀粉，首先将淀粉降解为寡糖、麦芽三糖和麦芽糖，然后将寡糖、麦芽三糖进一步降解为麦芽糖和葡萄糖；水解支链淀粉，由于不能水解α-1.6糖苷键，产物除麦芽糖、少量葡萄糖外，还有带α-1.6键的小分子极限糊精。

糊精:分子式为(C6H10O5)n•H2O，为白色或类白色的无定形粉末；无臭，味微甜。在沸水中易溶，在乙醇或乙醚中不溶。

直链淀粉显蓝色，据认为这是由于葡萄糖单位形成六圈以上螺旋所致。其分子量约1万-200万,250-260个葡萄糖分子,以(1 4)糖苷键聚合而成.呈螺旋结构。一个螺旋圈所含葡萄糖基数称为聚合度或重合度,当淀粉形成螺旋时,碘分子进入其中,糖的羟基成为供电子体,碘分子成为受电子体,形成络合物.

而支链淀粉除了(1 4)糖苷键构成糖链以外,在支点处存在(1 6)糖苷键,分子量较高.遇碘显紫红色.遇碘显紫红色。

淀粉水解时一般先生成淀粉糊精（遇碘呈蓝色），进而生成红糊精（遇碘显红色），再生成无色糊精（遇碘不显色）及麦芽糖，最终生成葡萄糖。

糖元遇碘显红色。

总结一下：

当链长小于6个葡萄糖时,不能形成一个螺旋圈.

当聚合度为20左右时,碘遇淀粉显红色

当聚合度为20~60时,碘遇淀粉显紫红色

当聚合度大于60时,碘遇淀粉显蓝色）

α-淀粉酶β淀粉酶糖化淀粉酶

淀粉糊精麦芽糖葡萄糖

遇碘显蓝色遇碘显红色

（淀粉遇碘显色原理：淀粉、糊精等与碘结合为淀粉/糊精-碘包合物显色。分子结构不同，结合方式不同，颜色不同。）

3.石英砂的吸附作用

石英砂吸附酶的物理吸附也称范德华吸附，它是由吸附质和吸附剂分子间作用力所引起，此力也称作范德华力。由于范德华力存在于任何两分子间，所以物理吸附可以发生在任何固体表面上。吸附剂表面的分子由于作用力没有平衡而保留有自由的力场来吸引吸附质，由于它是分子间的吸力所引起的吸附，所以结合力较弱，吸附热较小，吸附和解吸速度也都较快。被吸附物质也较容易解吸出来，所以物理吸附在一定程度上是可逆的。如：活性炭对许多气