脂肪酶发酵工艺

湖北大学

发酵工程与设备课程设计

题目脂肪酶的发酵工艺

专业年级08级生物工程

学生姓名文乐雷

学号****************

指导老师……..

2011 年 5 月 24 日

目录

1.脂肪酶的简介 (2)

1.1脂肪酶的定义 (2)

1.2脂肪酶催化的反应 (2)

1.3脂肪酶的结构特点 (2)

1.4脂肪酶的特性 (2)

1.5脂肪酶的来源 (2)

2.产脂肪酶菌株的筛选方法 (2)

2.1筛选路线 (2)

2.2初筛方法 (2)

2.3复筛方法—摇瓶培养 (3)

3.脂肪酶活力的测定 (3)

3.1酸碱滴定法 (3)

3.2对硝基苯酯法 (3)

4.产脂肪酶微生物的培养基及培养条件 (3)

5.脂肪酶生产的基本工艺流程图 (4)

6.南极假丝酵母生产脂肪酶 (4)

6.1菌种、培养基及试剂仪器 (4)

6.2发酵过程 (4)

6.3 脂肪酶的热稳定性和 pH稳定性测 (4)

6.4南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究 (4)

7.脂肪酶发酵生产过程 (5)

7.1分批发酵 (5)

7.2反复分批发酵 (5)

7.3补料分批发酵 (5)

7.4连续发酵 (5)

8.脂肪酶的固定化 (5)

8.1固定化脂肪酶的优、缺点 (5)

8.2脂肪酶固定化方法 (5)

9.双水相体系提取脂肪酶 (6)

9.1材料 (6)

9.2分析内容 (6)

9.3硫酸铵的定量分析 (6)

9.4试剂配制 (6)

9.5相图节线制作 (6)

9.6双水相体系制备 (6)

10.脂肪酶在食品工业中的应用 (6)

10.1三酰甘油水解 (6)

10.2 三酰甘油的改性 (7)

10.3催熟和发酵 (7)

10.4脂类合成 (7)

11.脂肪酶在其他方面的应用 (7)

11.1脂肪酶在纺织物中的应用 (7)

11.2脂肪酶的医学应用 (7)

11.3脂肪酶在生物柴油中的应用.....................................。7 11.4脂肪酶在生物传感器中的应用. (7)

11.5在环境保护中的应用 (8)

1、脂肪酶的简介

1.1脂肪酶的定义[1]

脂肪酶(EC3．1．1．3，Lipase) ,又称甘油酯水解酶 , 是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。

脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成，活性中心靠近分子疏水端。脂肪酶结构有 2个特点：( 1 )脂肪酶都包括同源区段：His—X—Y—Gly—Z ,Ser—W—Gly或Y—Gly—His—Ser—W—Gly(x、Y、w、Z是可变的氨基酸残基)；( 2 )活性中心是丝氨酸残基。

1.4脂肪酶的特性

位置专一性：是指酶对底物甘油三酯Sn-1(或3)和Sn-2酯键的识别和水解。

立体专一性一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的1位和3位酯键识别和选择性水解。如猪胰脂肪酶水解甘油三酯时没有1和3位立体选择性;人奶和牛奶中脂蛋白脂肪酶优先水解1位酯键。

1.5脂肪酶的来源[2]

脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中而微生物脂肪酶种类最多,广泛存在于细菌、酵母和霉菌中,最易获得和大规模生产,且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性,因此是工业用脂肪酶的重要来源。

细菌脂肪酶细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵,生产比较容易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶,且在pH4~11、温度30℃~60℃间具有良好的稳定性。假单胞菌属的细菌脂肪酶应用最为广泛。

真菌脂肪酶真菌脂肪酶具有温度和pH稳定性、底物特异性以及在有机溶剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅速。商业化的真菌脂肪酶主要有:黑曲霉,米曲霉等。

2.产脂肪酶菌株的筛选方法

2.1筛选路线

采样→富集培养→初筛→复筛→检测酶活→鉴定菌种→保藏菌种

2.2初筛方法

可淘汰85％一90％不符合要求的微生物，利用平皿的生化反应进行分离。

①Rhodamine B 平板筛选法

筛选原理：脂肪在脂肪酶的催化作用下水解生成甘油和脂肪酸，脂肪酸能与RhodamineB 的阳离子发生作用，生成黄色的荧光物质，所以用紫外灯的观察，产脂肪酶的菌株周围会出现荧光圈，依据荧光圈的大小进行菌种的筛选。

②溴甲酚紫平板筛选法

筛选原理：溴甲酚紫作为一种显色剂，其pH变色为5.2—6.8，在碱性条件下显紫色，在酸性条件下显黄色，脂肪在脂肪酶的催化作用下生成的脂肪酸会使培养基的pH降低，产脂肪酶菌株的周围会出现黄色的透明圈，根据透明圈的有无和大小来筛选产脂肪酶的菌株，透明圈越大说明产脂肪酶活力越强。

③琼脂块培养法

将分离培养基用灭菌的打孔器制作成许多单个的直径约0.6 cm 的小琼脂块, 排放在干净的培养皿内, 将挑选的菌株接种在这些小琼脂块上培养,让其充分生长, 然后依次再将长满菌的小琼脂块放到酶活测定板上, 28℃培养1～ 3 d, 观察各菌落周围油脂水解圈的大小, 水解圈越大，酶活越强，将水解圈大的菌株纯化后保存在斜面培养基上。

2.3复筛方法—摇瓶培养

种子培养基→发酵培养基→收集菌体和上清液，分别测酶活。

3.脂肪酶活力的测定

3.1酸碱滴定法

反应体系：橄榄油聚乙烯醇乳化液，0.025M、pH7.5的磷酸缓冲液，0.05NNaOH标准液，1%酚酞指示剂酶液。

步骤：

①加5ml缓冲液+4ml乳化液于三角瓶中，40℃水浴中保温10min；

②加1ml酶液，40℃反应15min；

③15min后立即加入15mL95%的乙醇终止反应；

④加酚酞指示剂2-3滴后用NaOH滴定到微红色，在30s内不消失为滴定终点，记下碱的消耗量，重复两次取平均值；

⑤作对照：加缓冲液、底物后先加乙醇，在加酶液。

结果计算：单位/克=(A-B)*n*f/t*w

3.2对硝基苯酯法

反应体系：25mmol/L对硝基苯辛酸酯-异丙醇溶液，异丙醇-DMSO混合液，异丙醇：DMSO=2:1，100mmol/LTris-HCL缓冲液80mmol/LCaCL2溶液，酶液及灭活的酶液1%SDS 步骤：

①在试管中加入75ul异丙醇-DMSO、25ul底物、0.9ml缓冲液，100ulCaCL2溶液，37℃保温5min；

②五分钟后加入0.5ml酶液反应10min；

③10min后加入1ml1%SDS终止反应；

④作对照；

⑤用分光光度计测定OD；

⑥计算酶活。

4.产脂肪酶微生物的培养基及培养条件[3]

产脂肪酶微生物的培养基主要由碳源、氮源和无机盐离子组成。到目前为止，据有关文献报道，用作脂肪酶发酵的碳源通常为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜、麦麸皮、小麦粉等碳水类化合物。当然也有例外，有报道称菌株 Acremonlum strictum的最佳碳源是木糖(Okeko，1990)，另有Geotrichum sp菌是利用油脂或者脂肪酸作为碳源；同时，大量研究表明：不同的微生物种类，在发酵生产脂肪酶时对碳源的选择存在明显的差别(陈守文，1998)(黄家岭，2008)。

Yoshitaka的研究表明，Fe2+、Fe3+能促进Alcaligenes sp产酶，而Ba2+、C02+则对其产酶活性则没有任何影响；据朱明华报道，无机离子K+、Na+、Mg2+、ca2+等对假单胞茵产脂肪酶活性具有促进作用，而Mn2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、C02+、Cu2+等则对该菌产脂肪酶活性具有抑制作用(朱明华，1991)。另外，同种微量元素，不同浓度对菌株产酶活性的影响也不同，陶文沂报道称微量Ca2+可促进地霉产酶活性增强，而高浓度时则表现为抑制作用(陶文沂，1990)。

产脂肪酶微生物的常用氮源为黄豆饼粉、蛋白胨i牛肉膏、酵母粉、尿素、硝酸钠等。与碳源类似，不同的氮源适用于不同微生物。通常情况，复合氮源比单一的无机氮或有机氮作为氮源，更有利于提高微生物发酵产酶活性。不同的菌株对氮源的要求不同：Tsujisaka 认为对于霉菌，发酵生产脂肪酶受氮源的影响比其它菌种要高；而菌株Mucorlipolytica、Aapergillus niger发酵产脂肪酶活性则受氮源的影响较小，动植物有机氮或尿素都能够满足其发酵产酶对氮源的要求。

发酵培养基起始pH对微生物脂肪酶产量有着显著影响，多数菌株最适pH为7-8。Pal