四环素降解实验

四环素降解实验
一、高效液相色谱法的建立
1、色谱条件
色谱柱：ODS柱（C18柱）:
流动相：甲醇（色谱纯）-0.01mol/L甲酸水溶液（4:6，v/v），使用前超声脱气10min
流速：1.0 mL/min
检测器：紫外检测器（UV）: 波长350/ 355 nm
进样量：20 μL
试验结果：确定优化的色谱条件
2、标准溶液的配置
准确称取3种标准物质0.0100g溶于甲醇（色谱纯），定容100mL，获得浓度为0.100mg/mL（100mg/L）的标准储备液，冷冻储藏。

3、标准工作液的配置
准确移取一定体积的标准储备液，配制浓度为20—1000 µg/L
4、试验结果所需数据
（1）仪器检出限（S/N=3）
（2）仪器定量限（S/N=10）
（3）标准曲线：做五个浓度点，其中定量限为最低点，求线性范围、线性相关系数（r≧0.99以上）、和曲线方程
二、土壤样品的制备
取土样10Kg，自然风干，粉碎，过筛（100目，0.2mm），平均分为三份，准备三种药物的降解试验
三、提取方法的建立
1、提取溶剂：
Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲溶液( 提取液) ，分别称取12. 9 g 柠檬酸、10. 9 g 磷酸氢二钠、37. 2 g 乙二胺四乙酸二钠，加900 mL 水溶解后，用1 mol /L 氢氧化钠溶液调pH 至4. 0 ±0. 5，加水稀释至1 000 mL。

2、提起方法
准确称取2 g 土壤样品于50mL 聚丙烯离心管中，准确加入Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲溶液5mL，涡旋混匀2 min，超声提取5 min，于以5000 r /min 离心5 min 后，将上清液移入至另一50 mL 聚丙烯离心管中，残留物再加入5 mL 提取液提取1 次，5 000 r /min 离心5min，合并提取液备用。

准确移取上清液2mL过0.45µm的水性膜，进行HPLC/UV 分析试验结果：确定优化的提取条件
3、试验结果所需数据
添加回收率：3个浓度，每个浓度3次重复
四、降解试验
1、药物浓度对降解的影响
（1）三个药物浓度：（根据前面的检测结果确定）
（2）土壤处理：试验前，准确称取500g制备好的干燥的土壤加水至最大含水量的50%-60%，（最大含水量采用纸杯滴水法测定），混合均匀至于塑料袋中2h，使水分混合均
匀。

（3）称取土样：准确称取5g处理好的土壤样品与50mL干净的烧杯中，共称取80份，其中每个浓度做一次重复，每个浓度做10个点，共20份，同时做空白，共计80份（4）进行试验：称取好的土样烧杯做好标记，添加相应浓度的药物标准溶液，然后用保鲜膜覆盖好，防止水分流失，在上面扎几个小孔，置于温度稳定的环境中培养，所有样品采用称总重法每周调节含水量一次，根据标号分别在固定的时间内取出测定，（取样时间：0h、4h、10h、1d、2d、4d、6d、10d、15d、20d），所取样品当天测定完成。

2、不同土壤湿度对降解的影响
土壤处理不同的湿度（30%、50%、70%），观察湿度的影响，根据上述浓度试验结果，取样测定。

3、高温灭菌和光照对降解的影响
土样采用高温高压灭菌, 先将5g土样分别在120ºC灭菌1 h, 重复灭菌3次, 再加入药物标准储备液获得灭菌土样。

同时准备未灭菌处理的土样两份，一份与灭菌样品一起避光培养，一份放置光照处培养。