噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术的产生取决于 ３ 项实验技术 的 发 展 ： １） ＰＣＲ 技 术 的 发 展 使 人 们 可 以 用 一 组 引 物 （ 免疫球蛋白可变区中骨架部分的保守序列）， 通过 ＲＴ－ ＰＣＲ 直 接 从 总 ＲＮＡ 克 隆 出 全 套 免 疫 球 蛋 白 可 变 区 基 因 。２） 大 肠 杆 菌 可 以 将 有 抗 体 活 性 的 免 疫 球 蛋 白 分 子 片 段 分 泌 入 周 质 腔 （ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ） 。３） 噬 菌体展示技术的建立， 即将抗体基因插入到丝状噬菌 体衣壳蛋白基因中， 使抗体基因对应的表达产物融合 在噬菌体衣壳蛋白中形成融合蛋白， 呈现在噬菌体表 面 ， 形 成 含 有 全 套 抗 体 谱 （ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ） 的 噬 菌 体 抗 体 库 ， 进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体， 是噬 菌体抗体库技术的核心。 ２ 丝状噬菌体（ｆｉｌａ ｍｅ ｎｔｏｕｓ ｐｈａ ｇｅ ）的生物学特征
关键词 噬菌体 抗体 表面展示
噬 菌 体 抗 体 （ ＰｈＡｂ） 是 指 抗 体 或 抗 体 片 段 （ Ｆａｂ、Ｆｖ 或 ｓｃＦｖ） 基 因 通 过 与 噬 菌 体 衣 壳 蛋 白 基 因 连 接 ， 以 融 合 蛋 白 的 形 式 表 达 在 噬 菌 体 表 面 的 抗 体 分 子 。用 Ｂ 淋 巴细胞全套抗体可变区基因克隆并组装成的噬菌体 群体称之为噬菌体抗体库。该技术不经免疫， 绕过杂 交瘤技术， 直接利用抗原从抗体库中筛选特异性抗 体， 较好地解决了人杂交瘤技术低效的难题， 使人源 抗体制备进入了一个全新时代。 １ 噬菌体抗体库技术的兴起
ＰⅧ含 量 最 丰 富 ， 每 个 噬 菌 体 含 有 ２ ７００￣３ ０００ 拷 贝 ， 分 子 量 为 ５１２×１０３， 其 前 体 也 含 有 １ 个 ２３ 氨 基 酸
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生物学源自文库报
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的信号肽。基因Ⅷ的 Ｎ 端可融合表达短肽（ 五肽或六 肽） ， 而较长的肽链则因形成空间障碍而影响噬菌体 装配， 使其失去感染力， 但在辅助噬菌体的作用下， 可 通过提供野生型 ＰⅧ蛋白， 降低重组外壳蛋白。因此 可融合较大的多肽甚至抗体片段。因 ＰⅧ蛋白的拷贝 数多， 一般用于筛选亲和力较低的抗体。
根据抗体基因来源的组成的不同， 抗体库大致分 为 ４ 种 ： １） 天 然 抗 体 库 （ ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ） ， 从 未 经 免 疫 的 动 物 或 人 外 周 血 淋 巴 细 胞 、骨 髓 细 胞 、脾 细 胞获得 Ｂ 淋巴细胞， 减少因抗原刺激所引起的 Ｂ 细胞 谱 的 变 化 。由 这 些 细 胞 中 提 取 ＲＮＡ， 反 转 录 成 ｃＤＮＡ， 用 与 抗 体 ＶＨ、ＶＬ 支 架 序 列 ＦＲ１、ＦＲ４ 互 补 的 寡 核 苷 酸 为 引 物 ， 以 ＰＣＲ 方 法 获 得 Ｖ 基 因 ， 克 隆 到 噬 菌 体 或 噬菌质粒载体中表达并展示， 这种噬菌体抗体库称为 天然抗体库。天然噬菌体抗体库的主要优点： ①建一 个抗体库， 可用于多种不同抗原； ②可得到人源抗体； ③可 得 到 针 对 自 身 抗 原 、非 免 疫 原 性 的 或 毒 性 物 质 的 抗体； ④抗体产生用 ２￣４ 轮淘选， 仅需 ２ 周左右的时 间 ； ⑤当 抗 体 库 容 量 很 大 时 ， 可 得 到 高 亲 和 力 抗 体 。主 要不足： ①抗体库库容量小时， 得到的抗体亲和力较 低 ； ② 建 库 费 时 、费 力 ； ③ 所 谓“ 天 然 ”并 非 真 正 完 全 天然， 受个体发育限制如对自身反应性克隆的抑制或 对 自 身 抗 原 的 免 疫 耐 受 、Ｂ 细 胞 供 者 的 不 明 确 免 疫 史 、激 活 的 Ｂ 细 胞 及 浆 细 胞 可 能 存 在 ， 它 们 的 抗 体 可 变区基因已经历了超突变， 影响了 Ｂ 细胞的多样性。 ２） 免 疫 抗 体 库 （ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ） ， 从 免 疫 动 物或某些情况下人的免疫 Ｂ 细胞中， 如经抗原免疫的 小鼠脾淋巴细胞或致敏的人外周血淋巴细胞提取总 ＲＮＡ， 获 得 Ｖ 基 因 ， 由 此 构 建 的 噬 菌 体 抗 体 库 称 免 疫 噬 菌 体 抗 体 库 。得 到 的 抗 体 是 针 对 某 一 种 特 异 性 抗 原 的抗体， 有的已经历了免疫系统亲和性成熟过程， 具 有较强的抗原特异性和亲和力。主要不足： ①免疫动 物费时， 对目的抗原机体免疫应答有不确定性， 有些 抗 原 如 自 身 抗 原 、有 毒 物 质 对 人 不 能 进 行 免 疫 ； ② 每 一 种 新 抗 原 需 要 建 立 一 个 新 噬 菌 体 抗 体 库 。３） 半 合 成 抗 体 库 （ ｓｅｍｉ － ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ） ， 该 抗 体 库 抗 体 重 链 可 变 区 基 因 片 段 中 的 互 补 决 定 区 （ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ－ ｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ， ＣＤＲ） ＣＤＲ１ 和 ＣＤＲ２ 来 自 于 人 ５０ 个 人 胚 系 ＶＨ 基 因 ， 而 ＣＤＲ３ 则 是 人 工 合 成 的 编 码 ４￣１２ 个 氨 基 酸 的 随 机 序 列 。该 库 库 容 量 极 大 ， 可 达 １０１２， 但 抗 体 的 亲 和 力 较 低 ， 同 时 人 工 合 成 的 ＣＤＲ３ 可 能 增 加 抗 体 的 免 疫 原 性 。４） 合 成 抗 体 库 （ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎ－ ｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ） ， 随 着 人 们 对 于 机 体 内 抗 体 产 生 过 程 中 ＤＮＡ 重 排 复 杂 过 程 的 清 楚 认 识 ， 以 及 对 许 多 抗 体 结 构 的研究， 业已证明大多数抗体的抗原结合点位于 ＣＤＲｓ 内 。 这 为 完 全 脱 离 自 然 个 体 构 建 抗 体 分 子 奠 定
在 丝 状 噬 菌 体 所 编 码 的 １０ 个 蛋 白 中 ， 与 噬 菌 体 展示有关的是 ＰⅢ和 ＰⅧ。ＰⅢ是噬菌体的吸附蛋白， 位于噬菌体的最尾端， 呈球形或线状， 每个噬菌体平 均 含 有 ５ 个 拷 贝 ， 分 子 量 为 ４２×１０３， 其 前 体 在 Ｎ 端 含 有 １８ 个 氨 基 酸 的 信 号 肽 。其 Ｃ 端 锚 在 外 壳 上 ， Ｎ 端 游 离 在 外 。大 多 数 研 究 采 用 ＰⅢ融 合 ， 原 因 是 ＰⅢ蛋 白 在 容纳不同大小的外源序列时比较灵活， 如分子量高达 ５０×１０３ 大 小 的 外 源 蛋 白 已 被 成 功 地 展 示 。基 因Ⅲ区 有 ２ 个位点可供外源基因片段插入， 即基因Ⅲ氨基端（ Ｎ 端） 或近 Ｎ 端可屈伸臂区内， 表达的融合蛋白在辅助 病毒超感染后， 与野生型 ＰⅢ蛋白一起竞争性地组装 到 噬 菌 体 表 面 ， 形 成“杂 合 ”噬 菌 体 。 融 合 蛋 白 与 野 生 性 ＰⅢ蛋白的装备比例与其各自的启动子强弱相关。 研 究 表 明 ， ＬａｃＺ 启 动 子 驱 动 的 抗 体 分 子 与 ＰⅢ融 合 蛋 白 展 示 在 噬 菌 体 表 面 一 般 为 单 价 。由 于 基 因Ⅲ单 价 表 面展示体系可消除多价形成亲和力的作用， 有利于在 免 疫 富 集 筛 选 过 程 中 获 得 高 亲 和 力 克 隆 。所 以，该 系 统 主要用于抗体库的构建， 适宜于筛选亲和力较高的抗 体。
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噬 菌 体 抗 体 库 技 术＊
马 小 兵 １， ２＊ ＊ 畅 继 武 ２
（ １ 华 北 煤 炭 医 学 院 病 理 教 研 室 天 津 ２ 天 津 医 科 大 学 天 津 市 泌 尿 外 科 研 究 所 天 津 ３００２１１ ）
摘 要 噬 菌 体 抗 体 库 技 术 是 指 从 人 外 周 血 、脾 或 骨 髓 淋 巴 细 胞 提 取 总 Ｒ ＮＡ， 利 用 逆 转 录－ 多 聚 酶 链 反 应 （ Ｒ Ｔ － ＰＣＲ ） 方 法 扩 增 抗 体 的 全 套 可 变 区 基 因 ， 通 过 噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 ， 把 抗 体 Ｆａｂ 段 或 单 链 抗 体 表 达 在 噬 菌 体 表 面 ， 构 建 人 源 抗 体 库 。 噬 菌 体 抗 体 将 基 因 型 （ ｇｅｎｏｔｙｐｅ） 和 表 型 （ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ） 统 一 于 一体， 将选择能力和扩增能力偶联起来， 具有强大的筛选能力， 能够在体外模拟体内的抗体生成过程， 使抗体工程技术进入了一个新的时代。
丝 状 噬 菌 体 属 于 单 链 ＤＮＡ 病 毒 ， 其 基 因 组 为 闭 合 环 状 的 单 股 正 链 ＤＮＡ（ ｓｓＤＮＡ） 。这 种 噬 菌 体 只 能 通 过 大 肠 杆 菌 的 性 菌 毛 才 能 将 其 ＤＮＡ 注 入 细 菌 ， 因 此 它 只 感 染 含 有 Ｆ 因 子 的 雄 性 大 肠 杆 菌 。丝 状 噬 菌 体 呈 长丝状， 外壳蛋白围绕基因组呈规则螺旋排列， 其基 因 组 由 约 ６ ４００ 个 脱 氧 核 苷 酸 组 成 ， 但 丝 状 噬 菌 体 的 长 度 可 以 随 插 入 ＤＮＡ 片 段 大 小 的 不 同 而 发 生 变 化 。 基 因 组 共 １０ 个 基 因 ， 编 码 １０ 种 蛋 白 质 ， 这 些 蛋 白 在 分 子 量 与 拷 贝 数 上 有 很 大 差 别 。５ 个 衣 壳 蛋 白 （ ＰⅢ、Ｐ Ⅵ、ＰⅦ、ＰⅧ、ＰⅨ） ， ３ 个 是 合 成 ＤＮＡ 所 必 需 的 （ ＰⅡ、Ｐ Ⅴ、ＰⅩ） ， ２ 个 组 装 蛋 白 （ ＰⅠ、ＰⅣ） 。在 电 镜 下 ， 噬 菌 体 颗 粒 呈 细 长 、易 弯 曲 的 管 状 ， 由 约 ２ ７００ 个 拷 贝 的 ＰⅧ
＊ 基 金 项 目 ： 天 津 市 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （ ０４３６０８４１１ ） ＊ ＊ 通讯作者
蛋 白 包 装 它 的 正 链 ＤＮＡ。在 管 形 的 一 端 是 衣 壳 蛋 白 Ｐ Ⅲ、ＰⅥ， 另 一 端 是 ＰⅦ、ＰⅨ。ＰⅢ蛋 白 是 噬 菌 体 感 染 所 必 需 的 。ＰⅢ、ＰⅥ蛋 白 对 于 噬 菌 体 的 稳 定 性 很 重 要， 而 ＰⅦ、ＰⅨ是 噬 菌 体 包 装 所 必 需 的 。 ３ 噬菌体展示技术的原理
由于噬菌体的基因组中只含 １ 个拷贝的基因Ⅲ 和基因Ⅷ， 因此当外源基因与基因Ⅲ或基因Ⅷ连接 时， 其重组基因产物都将形成 ＰⅢ或 ＰⅧ与外源蛋白 的 融 合 蛋 白 ， 这 样 会 妨 碍 外 壳 蛋 白 正 常 功 能 。ＰⅢ的 融 合蛋白无法识别大肠杆菌性菌毛， 使噬菌体不能感染 大 肠 杆 菌 而 无 法 增 殖 。 现 主 要 采 用 噬 菌 粒 （ ｐｈａｇｅｍｉｄ） 和 辅 助 噬 菌 体 （ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ） 的 双 基 因 组 系 统 解 决 这 一 问 题 。 在 ｐｈａｇｅｍｉｄ ＤＮＡ 中 含 有 外 源 肽 段 与 ＰⅢ（ 或 ＰⅧ） 的重组基因和便于筛选的抗药性基因， 此外它具 备复制原点和噬菌体的基因间隔区， 可被辅助噬菌体 基 因Ⅱ产 物 有 效 识 别 。辅 助 噬 菌 体 基 因 组 中 含 有 正 常 的 基 因Ⅲ和Ⅷ， 同 时 也 含 有 ＤＮＡ 复 制 和 组 装 所 需 全 套 基 因 ， 但 其 基 因 间 隔 区 插 入 了 ｌａｃ Ｚ 序 列 ， ＰⅡ蛋 白 对 它 不 能 有 效 识 别 。当 含 有 重 组 基 因 的 ｐｈａｇｅｍｉｄ 进 入 大肠杆菌后， 再用辅助噬菌体进行感染， 这样所产生 的子代噬菌体既展示 ＰⅢ（ 或 ＰⅧ） 与外源肽段的融合 蛋白， 又因同时含有正常的 ＰⅢ和 ＰⅧ， 使噬菌体能正 常 感 染 、组 装 和 增 殖 。同 时 由 于 ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ 合 成 的 Ｐ Ⅱ蛋 白 优 先 识 别 ｐｈａｇｅｍｉｄ 上 的 正 常 基 因 间 隔 区 ， 启 动 滚 环 复 制 ， 产 生 ｓｓＤＮＡ， 通 常 噬 菌 体 外 壳 蛋 白 所 包 装 的 ｓｓＤＮＡ 主 要 来 自 含 有 重 组 基 因 的 ｐｈａｇｅｍｉｄ ＤＮＡ， 一 般 多 于 包 装 ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ 基 因 组 的 ５０ 倍 。因 此 噬 菌 粒更适合于展示抗体分子， 容易导入新的基因， 连接 转化效率高， 能获得较大的库容。 ４ 制备噬菌体抗体文库的一般流程
白 ， 在 辅 助 噬 菌 体 ＶＣＳＭ１３ 提 供 噬 菌 体 蛋 白 的 情 况 下， 噬菌粒被包装成头部展示目的蛋白的噬菌体； 在 ｓｕｐ－ 菌 株 中 琥 珀 突 变 的 终 止 密 码 子 起 作 用 ， 只 产 生 可 溶 性 的 抗 体 片 段 。噬 菌 体 抗 体 库 经 过 固 相 抗 原 的 多 次 筛 选 （ 吸 附－ 洗 脱－ 扩 增 ） 后 可 得 到 特 异 性 强 、亲 和 力 高 在头部表达目的蛋白的噬菌体。 ５ 噬菌体抗体库的种类
首 先 分 离 淋 巴 细 胞 、提 取 总 ＲＮＡ， 用 ６ 核 苷 酸 随 机 引 物 、ｐｏｌｙＴ 或 者 是 设 计 好 的 ＰＣＲ 下 游 引 物 逆 转 录 形 成 ｃＤＮＡ 第 １ 链 。 如 果 是 制 备 ｓｃＦｖ 抗 体 库 ， 用 ＰＣＲ 扩 增 ＶＨ、Ｖκ、Ｖλ基 因 ； 如 果 制 备 Ｆａｂ 抗 体 库 ， 则 应 该 扩 增 Ｆｄ （ ＶＨ＋ＣＨ１） 基 因 以 及 ＬＣ（ 抗 体 的 轻 链 ） 基 因 片 段 。设 计 引 物 时 ， 两 种 抗 体 库 的 上 游 引 物 相 同 ， 均 根 据 成 熟 的 Ｖ 区 外 显 子 或 者 引 导 序 列 ５′端 的 序 列 设 计 ； 下 游 引 物 不 同 ， ｓｃＦｖ 库 从 Ｊ 区 的 序 列 中 设 计 ， Ｆａｂ 抗 体 库 从 恒 定 区 序 列 中 设 计 。ＶＨ、ＶＬ 分 别 经 ＰＣＲ 扩 增 后 纯 化 连 接 ， 重 叠 延 伸 ＰＣＲ 是 ｓｃＦｖ 两 条 链 的 连 接 普 遍 采 用 的 方 法 。Ｆａｂ 抗 体 轻 重 链 的 连 接 方 法 很 多 ， 最 简 单 的 方 法 是 把 ＶＨ 与 Ｖκ或 Ｖλ基 因 先 后 克 隆 到 １ 个 载 体 上 ， 或 者 通 过 ＰＣＲ 连 接 后 再 克 隆 到 载 体 上 。 载 体 有 许 多类型， 现在通常使用的是噬菌粒。这种噬菌粒在抗 体 片 断 与 Ｐ Ⅲ 蛋 白 之 间 插 入 了 琥 珀 密 码 子 （ Ａｍｂｅｒ ｃｏｄｏｎ） ， 在 ｓｕｐ＋菌 株 中 表 达 目 的 蛋 白 与 ＰⅢ的 融 合 蛋
噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体衣 壳蛋白基因相连， 并插入到噬菌体表达载体， 使多肽 或蛋白质与其衣壳蛋白氨基端融合并展示在噬菌体 表面， 被展示的多肽或蛋白可保持相对独立的空间结 构 和 生 物 活 性 ， 重 复 性 好 ， 生 产 成 本 低 廉 。由 于 这 种 病 毒颗粒的基因产物无需裂解宿主细胞便分泌到培养 液中。免去了复杂费时的后期纯化过程， 使成本大大 降低。