5.免疫组化染色中常见问题及处理

病理科常用肿瘤鉴别诊断标记物
免疫组化的临床应用
2、肿瘤的恶性程度与预后判断
近20年来，以P16（宫颈癌）、P504S（前列 腺癌）、Ki-67（肿瘤增殖、预后监测）、 PCNA（肿瘤增殖、预后监测）、P53（癌基 因、预后监测）等为代表的数十种恶性肿瘤 相关抗体相继被广泛应用于肿瘤性质的判断 和预后，从而使恶性肿瘤的辨识更加精确。
2.染色阳性强度和阳性检出率相结合：
阳性细胞数＜25%
－
25%-50%
+
50%-75%
++
＞75%
+++
四、其他常见问题
（三）假阳性、假阴性及背景着色的原因 1、假阳性的原因 ➢抗体与非特异性抗原结合 ➢抗体浓度过高 ➢非特异性吸附 ➢内源性酶的催化作用 ➢人为判断失误 ➢外源性或内源性色素的干扰
（六）孵育方法及时间
环境：特制的湿盒内，避免切片干燥致染 色失败
温度及时间：37℃，1h
延长孵育时间：4℃过夜
（七）显色
两种方法：
（1）3,3’-二氨基联苯胺（DAB） 配制方法及注意事项：
现用现配，配好后30min内使用，作用时间 5min以内；配好后需过滤
DAB TBS（0.05mol/L，pH7.6 ） 30%H2O2（显色前加入）
－
－
抗体稀释度的测定
（2）棋盘法：当一抗、二抗、三抗都未知 稀释度时
二抗稀释度 1:50
一抗稀释度
1:100
1:200
1:100 ++++(++) ++++(+) +++(－)
1:200 ++++(+) ++++(－) ++(－)
1:400 ++++(－) +(－)
－(－)
1:400 +(－) ++(－) －(－)
+
+
三、染色
（三）缓冲液
PH环境：抗原抗体反应的最适合PH为7.2~7.6 最常用的缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）
成分
用量
NaCl
8g
Na2HPO4 NaH2PO4 蒸馏水H2O
0.5g 0.2g 加至1000ml
三、染色
（四）抗原修复 原因？？？ 方法： 1.胰蛋白酶法：细胞内抗原的修复 2.胃蛋白酶法：细胞间质与基底膜抗原的修 复 3.热诱导的抗原修复（HIAR）：对大多数抗 原均有效
四、其他常见问题
2、假阴性的原因 ➢抗原：被分解破坏或含量低 ➢抗体：浓度过低、失活或效价过低 ➢孵育时间过短，抗原抗体未充分结合 ➢染色过程中切片过于干燥 ➢操作失误
四、其他常见问题
3、背景染色的原因 ➢组织标本固定不及时或固定时间过长 ➢切片过厚、脱蜡不彻底 ➢内源性酶封闭不完全 ➢非免疫血清封闭不正确 ➢一抗浓度过高 ➢PBS液冲洗不干净 ➢DAB的配制和使用不当，浓度过高
对照试验的设置 结果的判断 假阳性、假阴性和背景着色的原因
一、组织处理
组织自溶会导致抗原丢失，因此组织标本取 材固定需及时，这是做好免疫组化的第一步。
1、取材
时间：组织离体后2h内；厚度：0.2cm。
2、固定
固定剂：福尔马林； 固定时间：12h以内，固定时间过长会导致抗原检出率下降。
3、脱水、透明、浸蜡
宫颈上皮P16、Ki67染色
蓝色箭头示正常宫颈粘液上皮，红色示病变鳞状上皮
免疫组化的临床应用
3、肿瘤药物的使用指导
➢ 恶性肿瘤的传统治疗：手术、放化疗
➢ 新型治疗：进入21世纪，分子靶向治疗又逐步在国 内广泛应用于乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、膀 胱癌、胰腺癌、肝癌、胃肠间质瘤等诸多肿瘤方面， 尤其是在复发转移病例中，几乎成为肿瘤治疗的终 极方案。
免疫组化在临床上的应用
胚的发育过程
起源于同一胚层的 组织细胞形态结构
具有相似性
受精卵
卵裂
囊胚（囊胚腔）
原肠胚（原肠腔）
外胚层
中胚层
内胚层
表皮及 附属结 构
神经 系统 和感 官器 官
ห้องสมุดไป่ตู้脊索
内脏
真皮 排泄 肌肉 生殖
系统
循 环 系 统
的外 膜
呼 腺吸 体道
上 皮
消 化 道 上 皮
免疫组化的临床应用
抗体稀释度的测定
➢ 测定目的：找到特异性染色强，无背景染色时的抗 体稀释度（浓度）
➢ 测定方法：
（1）直接测定法：已知二抗、三抗的稀释度，求一 抗的稀释度
一抗稀释度
特异性染色强度 背景染色强度
1:50
++++
++
1:100
++++
++
1:200
++++
++
1:400
+++
+
1:500
++
－
阴性对照
（2）3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）
配制方法及注意事项：
AEC
二甲基甲酰胺
醋酸缓冲液（0.1mol/L，pH5.2）
H2O2
配制好后须过滤
4mg 1ml 14ml 适量
➢ 配制过程中须注意避免吸入或直接接触AEC粉末 ➢ 阳性部位呈红色 ➢ 因反应产物溶于乙醇，因此封片用甘油明胶
四、其他常见问题
三、染色
（一）去除内源性酶及内源性生物素
1.去除内源性酶
H2O2（浓度3%，室温10min）
2.去除内源性生物素
为什么要去 除？？？
使用亲和素试剂染色时；使用0.01%抗生物素处理组 织片
3.灭活碱性磷酸酶
左旋咪唑
三、染色
（二）抑制非特异性背景着色 常见原因：抗体被吸附到带有电荷的胶原 或结缔组织上 处理方法：非免疫血清处理，一般用2%10%的羊或牛血清 注意事项：非免疫血清处理后不能冲洗
免疫组化染色中常见问题 及处理
桂林医学院病理学教研室 梁路
2018.10.19
IHC染色中的常见问题
组织处理：取材；固定；脱水、透明、浸蜡
制片：载物片的处理（防脱片）；切片
染色
去除内源性酶及生物素 抑制非特异性背景着色 缓冲液 抗原修复 抗体的选用、分装、稀释及保存 孵育方法及时间 显色
其他常见问题
➢ 随着越来越多的肿瘤药物相关基因和蛋白的发现， 我们可以通过免疫组化的方法来检测相关基因和蛋 白的表达水平，来初步判断患者化疗和分子靶向药 物的适用范围，为下一步更精确的检测提供筛检依 据。
病理科乳腺癌免疫组化耐药标记
乳腺癌组织免疫组化染色
ER
Her-2
➢ 该病人检测结果：ER(+)，Her-2(+) ➢ 根据检测结果该病人的治疗，临床则可考虑化疗+内
（五）抗体的选用、稀释、分装及保存
1.抗体的选用
单克隆抗体
多克隆抗体
专一性强，非特异性反 专一性差，非特异性反应
应少
明显
价格较贵
价格低廉
效价较低但稳定
效价高
稀释范围窄（1:501:100）
稀释度广（1:100-1:1000）， 适应性强
根据实际情况选择
（五）抗体的选用、稀释、分装及保存
2.抗体的稀释 ➢原因：抗原抗体反应有比例的要求 抗体＞＞抗原：阳性反应变弱，出现假阳 性 ➢影响抗体稀度的因素： （1）抗体的浓度 （2）抗体溶液中非特异性蛋白的含量 （3）孵育时间 （4）染色方法的灵敏度
实际工作中，二抗与三抗的稀释度按照说明书使 用即可，只需测定一抗的稀释度
稀释液的配置
0.05mol/L,pH7.4的TBS100ml
TBS:三羟甲基 氨基甲烷缓冲 液
加热至60℃
加入明胶0.1g
溶解、冷却至室温
加入1.0g牛血清蛋白、 0.2gNaN3溶解
抗体的分装与保存
分装的目的： （1）防止污染 （2）反复冻融导致抗体效价下降 保存方式： 一般以﹣20℃保存，可存数年 稀释后的抗体4℃可保存1-3天
蛋白酶法
1.胰蛋白酶法： 浓度：0.1%的胰蛋白酶修复液 （0.1g胰蛋白酶+PH 7.8的0.1%CaCl2溶液） 温度：37℃ 时间：20-40min （根据标本固定时间及被检测抗原性质决定）
2.胃蛋白酶法： 浓度：0.4%（0.4g胃蛋白酶+0.1mol/L盐酸水溶 液）；37℃；10-30min
充分且不能过度，需严格控制
二、制片
切片 ➢平：无皱褶、无刀痕 ➢整：切片必须完整 ➢薄：厚度以3-5μm为宜，太厚容
易脱片，并影响染色效果
二、制片
防切片脱片（载玻片的处理）：
1、多聚左旋赖氨酸法
2、明胶硫酸铬钾法
3、3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（APES）法
免疫组化染色
为什么要防脱片？？
步骤多，水洗 时间长，组织 切片容易脱片
（一）对照试验的设置 1.阴性对照 2.阳性对照 3.空白对照 4.自身对照：
在日常病理诊断工作最常用、最实用的对照方法。例 如CD34正常可使血管壁着色，当CD34染色时血管壁 不着色，则本次染色的试剂或操作有误。
四、其他常见问题
（二）结果的判读
方法：
1.阳性细胞指数：阳性细胞与总细胞的百 分数；以十个视野的平均值表示
25mg 50ml 3μl
完全溶解 后须过滤
配制中的注意事项： （1）DAB有致癌性，配置过程中需做好自我 保护 （2）必须要过滤，否则为溶解的DAB颗粒会 沉积于组织内，影响结果 （3）DAB与H2O2浓度均不宜过高，否则可增 加背景着色
DAB染色，阳性部位呈棕色，一般用苏木素
进行复染
缺点：含内源性酶较多的组织用DAB显色时极易出现 背景色
1、特异性表
达与鉴别诊
断
HE
CK 2、恶性程度
与预后
3、指导治疗
Ki67
Her-2
免疫组化的临床应用
1.肿瘤细胞特异性抗体表达与鉴别诊断
➢ 利用肿瘤细胞的特异性抗体分辨其来源，以纠正我们在 主观认知上的偏差，以确保病理诊断的可靠性。
➢ 免疫组化技术发展至今，最重要的发展就是有上百种的 肿瘤细胞特异性表达抗体的发现和应用，从而使我们认 识肿瘤细胞的依据越来越具有客观性。
热诱导的抗原修复（HIAR）
修复液：pH6.0的枸橼酸缓冲液或pH8.0的EDTA(乙 二胺四乙酸)缓冲液 修复液最佳pH范围：6.0-10.0；修复液修复能力 随pH升高而增强
操作要点：温度要达到；时间要充分；最好不进 行HIAR处理 方法：
（1）水浴加热法：95℃，15min （2）微波加热法：96 ℃，10min，后停留2min （3）高压加热法：100℃，2min
分泌治疗（三苯氧胺）+分子靶向治疗（赫赛汀）