一种黄病毒引起鸭产蛋下降的诊断报告

一种黄病毒引起鸭产蛋下降的诊断报告

摘要:2010年以来湖北省部分地区蛋鸭群出现了严重的产蛋下降以及持续性死亡,对发病鸭进行了病理剖检以及病毒的PCR鉴定｡其中用RT-PCR检测鸭黄病毒为阳性,禽流感病毒､新城疫病毒和减蛋综合征病毒均为阴性｡对PCR扩增的鸭黄病毒目的片段进行回收测序,将测序结果与黄病毒属的7个不同的病毒群进行序列比对,表明该病毒与黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群的坦布苏病毒THCAr株和sitiawan株同源性较高,分别为89.3%和87.1%,具有较近的遗传进化关系｡

关键词:蛋鸭;产蛋下降;鸭黄病毒;RT-PCR;序列分析

The Diagnosis of a Flavivirus Causing Duck Egg Drops

Abstract: A disease causing severe egg drop and duck death was observed at many breeder duck farms in Hubei province since 2010. The samples showed positive to flavivirus, but negative to avian influenza virus, Newcastle disease virus and egg-drop syndrome virus by RT-PCR detection. The Sequence analysis based on the amplified flavivirus gene revealed that the strain was closely related to strain THCAr and sitiawan which submited to Ntaya virus group of Flavivirus genus in Flaviviridae family, and the identity was 89.3% and 87.1%, respectively.

Key words: laying ducks; decrease of egg laying; duck flavivirus; RT-PCR; sequence analysis

2010年以来湖北省部分地区大型养鸭场饲养的种鸭和蛋鸭出现了严重的产蛋下降,其中有 6 000多只蛋鸭出现不同程度的发病,产蛋率从90%~95%下降到40%~45%,并且死亡三四百只,死亡率达到6%左右,造成了巨大的经济损失｡临床剖检可见其卵巢严重充血､出血;肺脏有肉变,并有很多白色圆形小结节;脾脏充血肿大,而腺胃､肌胃及其交界处没有出血点,较正常｡对发病鸭进行了相关病毒的病原学检测,检测出鸭黄病毒阳性｡根据临床剖检情况,发病鸭卵巢充血､出血严重,并且从鸭病变的卵巢样品中扩增出阳性病毒,因此暂将该病毒命名为鸭出血性卵巢炎病毒(Duck hemorrhagic ovaritis virus,DHOV),现将相关研究结果报道如下,为兽医工作者临床诊断此病提供一定的依据｡

1材料与主要试剂

1.1材料

发病种蛋鸭的肺脏､脑､输卵管､卵泡等组织｡

1.2主要试剂

Tryptic Soy Agar (TSA)固体培养基,购自DifcoTM公司,按说明书配制后使用前加入新生牛血清至终浓度为10%;AMV反转录酶(Progema)､RNA酶抑制剂(Progema)､DEPC(Sigma)､dNTPs购自宝生物工程(大连)有限公司;Trans 2k plus DNA Marker购于北京全式金生物科技有限公司;Viral RNA Mini Kit购自上海华舜生物技术有限公司;Agarose Gel DNA Extraction Kit购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司氯仿等试剂为分析纯试剂｡

2试验方法

2.1细菌分离

无菌采取病(死)蛋鸭的肝脏､心血和脑组织,接种TSA固体平板､普通营养琼脂和麦康凯琼脂等培养基,置37 ℃温箱培养过夜｡

2.2引物设计和合成

参照Tembusu virus NS5 基因序列设计了两对引物｡第一对引物为上游引物DFV-U1:5′-AGAGCGATCTGGTACATGTGGCTAG-3′,下游引物DFV-D1:5′-GATAAGCTGGACGCACAGATTCG-3′,目的片段为450bp｡第二对引物为上游引物DFV-U2:5′-TGCTCTCAACACTTTCACGAATCTG-3′,下游引物DFV-D2:5′-GCAGCTCATGGAAATGGTGTGAAC-3′,目的片段为335 bp｡由上海生工生物工程有限公司合成｡

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引物的合成参考国家农业行业标准[1]､新城疫病毒(New castle disease virus,NDV)､减蛋综合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)的特异性引物由本实验室设计并合成保存｡

2.3病毒RNA的提取

将卵巢､肺､脑等病变组织剪碎,加生理盐水研磨后冻融3次,10 000 r/min离心5 min,取上清250 μL,根据RNA提取试剂盒说明书提取病毒全基因组RNA｡病毒RNA样品用30 μL的DEPC水溶解｡

2.4一步法RT-PCR及产物纯化

取5 μL RNA作为模板进行黄病毒的RT-PCR扩增｡RT-PCR反应体系为:5 μL 10×buffer(含Mg2+),1 μL dNTPs,1 μL上游引物,1 μL下游引物,1 μL 模板,0.5 μL Taq酶,0.5 μL M-MLV酶,10.0 μL H2O;RT-PCR反应条件为:42 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,33个循环;72 ℃ 10 min｡PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳｡电泳完成后切下目的片段,用Agarose Gel DNA Extraction Kit纯化回收DNA｡同时利用AIV､NDV､EDSV的特异性引物进行PCR扩增｡