第12章-激光共聚焦显微镜术

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贮存于冰箱中。
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2．石蜡切片 其优点是组织结构保存良好，在病理 和回顾性研究中有较大的实用价值，能连续切片（薄wenku.baidu.com），
组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组织化学技术的 石蜡切片制备与常规制片略有不同，主要是要在比较低的 温度下进行。 • 3．振动切片 可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切 成20~100µ m的厚片，以漂浮法进行染色。组织不冰冻， 无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组 织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能比较好地保 留组织细胞内脂溶性物质和细胞膜抗原。
• (3)体液沉淀涂片法。
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(4)穿刺吸取涂片法。
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二、固定
要特别注意固定剂的种类、固定的时间、温度和pH。
选择最佳固定液标准是最好地保持细胞和组织的形态结 构；最大限度地保存抗原的免疫活性（一些含重金属的 固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用）；不要用 可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，
还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光
（参见有关章节）。
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三、切片
由于激光穿透力强，所以用于激光共聚焦显微镜观察的 切片厚度可放宽至40~50µ m，切片不要太薄，以免结构的丢 失。
1．冰冻切片 为免疫组织化学染色中最常用的一种切片 方法。其最突出的优点是能够比较完好地保存多种抗原的免 疫活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。新鲜的 组织及已经固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如果不 染色，必须吹干，贮存于低温冰箱内，或进行短暂预固定后
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2．荧光多重标记 荧光显微镜在进行多种标记物的观测时，需要更换特殊 的滤片，以改变激发波长来达到观测目的。LSCM由于配有 3个独立的PMT，可同时获取多种信号数据，24比特图像显 示板可以使三色同时显示，所以可同时同屏采集和显示3个 不同发射波长的荧光色和一个混合图像，可方便地进行双标 或三标研究。如需要检测细胞膜、细胞核、细胞质内三种不 同的物质，可采用三种不同荧光标记的抗体标记样品，经激 光扫描、共聚焦采集数据后成像，即可在三个相应的部位观 察到标记的抗体阳性反应，并有重叠图像显示相互的关系， 同时可测得细胞的面积、周长，平均荧光强度、积分荧光强 度以及胞质内颗粒的数目等，对细胞进行全方位的定量分析。
手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本。前三者 均可为新鲜组织，后者一般是机体死亡2h以上的组织，组
织细胞会有不同程度的自溶，细胞组织的生化成分和抗原 成分有变性消失和严重的弥散。因此，对于新鲜采集或尸 检标本同样要尽快处理，或立即速冻进行冰冻切片，或立 即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如
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1．激光器
采用的是气冷式氪-氩离子混合激光管，
输出功率为15mW，激发光波长为 488、568及647nm，激 光束通过光纤电缆导入扫描头。
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2．扫描头
扫描头可以分为：①探测通道，由光电倍
增管（photo multiple tube，PMT）和相应共聚焦针孔及 滤过轮组成；②滤光块，本机配有进行细胞标记用的 T/1T2A 滤光块，有测活细胞钙离子的 B1 及 Open 滤光块， 测pH值及其它离子，可根据标本和目的进行不同选择；③ 扫描头，有管道与光学显微镜相连接。 • 3 ．光学显微镜 可配置直立或倒置显微镜， MRC-
• 荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针 孔先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管增强，在检测小孔 平面被探测收集，并将信号输送到计算机，在彩色显示 器上显示图像。 • 在这条光路中只有在焦平面上的光才能穿过探测针
孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦 的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，成 像也不清晰。由于照明针孔与探测针相对于物镜平面是 共扼的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔， 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以 激光做光源并对样品进行扫描，在此过程中经过两次聚 焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜
• 3．温度 有些荧光色素在20℃时即开始出现荧光淬 灭作用。温度越高淬灭作用越强，以至完全淬灭。所以荧光 染色必须温度适当 , 才能获得良好的效果。荧光抗体一般在 37℃或4℃下进行。FITC影响不大。 • 4．荧光淬灭物质 • （1）卤酸盐，其中以碘离子作用最强，其次为溴离子， 氯离子作用最小。 • （2）具有氧化作用的物质如氨基苯、硝基苯等。 • （3）某些金属离子，如铁离子、银离子等。 • 5．激发光强度 物质的分子和荧光色素的结合键有一 定强度，如果吸收的激发光能超过了它的结合键的结合力， 很容易使结合键断裂，而造成荧光发生褪色（淬灭和漂白）。 对之可降低激发光的强度
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（ 2） MRC-1024 共聚焦界面。硬件， 24 比特图像获得 及显示卡；软件，Lasersharp等。
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（3）显示器：17寸彩色监视器，分辨率1280×1024。
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二、LSCM的工作原理
传统的光学显微镜使用的是场光源。由于光散射，
在所观察的视野内样品的每一点都同时被照射并成像， 入射光照射到整个细胞的一定厚度，位于焦平面外的反 射也可通过物镜而成像，使图像的信噪比降低，影响了 图像的清晰度和分辨率。此外，传统的光学显微镜也只 能对局部作平面成像。 LSCM 采用激光束做光源，激光 束经照明针孔，由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上， 对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后，激发出的
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2．细胞CT 共聚焦成像利用照明点与探测点共扼这 一特性，可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及 来自样品中非焦平面的荧光，不仅可获得普通显微镜无法 达到的分辨率，同时具有浓度识别能力及纵向分辨率，因 而可看到较厚生物标本的细节。它以一个微动步进马达控 制载物台上下步进移动，其最小步距可为0.1µ m，可以逐 层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图 像，从而对生物样本进行无损伤的光学切片，得到各层面 的数据，即“细胞CT”。这一技术克服人工切片的各种不 足，并可将多层影像进行叠加，经计算机三维重建后得到 样品的立体结构。这是LSCM的主要功能与优点之一。
第一节 LSCM的结构和原理
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1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某 些基本原理，获得了美国的专利。1967年，Egger和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。1977年， Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间 的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为 SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。1986年MRC-500型改 进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。。随后 Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相继开发出 不同型号的共聚焦显微镜，应用的范围也越来越广泛。
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LSCM还可用于测定细胞面积、细胞周长和细胞核面 积、从而使形态学研究更为客观。同时通过改变观察角度 还可以突出特征性的结构。
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二、免疫荧光检测 在普通荧光显微镜，由于荧光图像在显微镜视野中的
荧光亮度与物镜的数值孔径的平方成正比，与其放大倍数 成反比，因此放大倍数越高，其影响越明显。但对荧光不 够强的标本，为提高荧光图像的亮度，又必须使用数值孔 径大的物镜。这样就不可避免地要以缩小视野作为代价， 造成图像信息的损失。LSCM由于其高度的敏感性，以及 其后期图像处理的强大功能，可以在使用较小数值孔径物 镜的条件下获得良好荧光强度图像。
不能迅速制片，可贮存于液氮或-70℃冰箱内备用。
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2．细胞标本
(1) 贴壁生长的培养细胞可直接进行固定、染色等
处理。
(2) 悬浮的培养细胞：沉淀涂片，细胞离心涂片器 （ cytospin）， 载 玻 片 上 涂 粘 附 剂 ： 如 多 聚 赖 氨 酸
（ 0.01%~0.5%），甲醛 - 明胶，铬矾明胶， Vectabond 试剂。
图8-1 激光共聚焦扫描显微镜的原理（光路图）
第二节
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LSCM的标本的处理
生物标本的范围很广，苯节主要指医学 研究领域的组织或细胞标本。激光共聚焦显 微镜可以观察石蜡切片、冰冻切片、涂片、 印片、铺片，培养的贴壁细胞、悬浮细胞等。
可根据不同的观察目的进行不同的染色。
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一、取材
1．组织标本 组织标本主要取之活组织检查标本、
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3．三维重建图象 三维重建后的图像不但能揭示细胞 内部的结构，而且还可以提供细胞的立体数据，如将重组 的图像旋转，随意观察细胞的各个侧面。也可研究细胞内 亚微结构的立体形态学变化及其空间关系。同时LSCM还 可研究细胞核和染色体的三维立体形态，借助光学切片功 能测定细胞深层的荧光分布及细胞内各种物质的变化。如 对DNA、RNA，蛋白质的含量，分子的扩散，细胞骨架等 进行准确的定性、定量、定位。
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一、LSCM的基本结构 LSCM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机 图像处理技术结合在一起的高技术设备。其主要配置有激 光器、扫描头、显微镜和计算机四大部分。包括数据采集、 处理、转换及相应的应用软件，图像输出设备及光学装置， 如光学滤片、分光器、共聚焦针孔及相应的控制系统（图 8-1）。现以MRC-1024型LSCM为例进行介绍。
第八章 激光扫描共聚焦显微镜术
光学显微镜作为细胞生物学的研究工具可以分辨 出小于其照明光源波长一半的细胞结构。随着光学、视
频、计算机等技术的发展而诞生的激光扫描共聚焦显微 镜（laser scanning confocal microscope，LSCM），使 现代光学显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的 结构，特别是对活细胞离子含量变化的定量检测，这是 以往的显微镜所望尘莫及的。
第三节 LCSM的主要功能
一、图像分析
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1．提高分辨率 通过使用荧光素交联的抗体作为特异 性的染料来测定细胞内的某些参数，在生物学研究中已获得 普遍应用。但这一技术常存在不在焦平面上荧光的干扰，造 成本底较高，而分辨不清组织结构的细节。由于LSCM的分 辨率小于0.2µ m，比普通光学显微镜高1.4倍，因此同一样品， 用LSCM观察到的图像比普通光学显微镜清晰，观察荧光染 料标记的样品，其效果更为明显。同时LSCM将高敏感性的 光电倍增管（PMT）合为一体，并应用数字滤过，使信/噪 比最佳化，排除了焦点以外的荧光干扰。
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1．荧光定量测量 荧光显微镜凭工作者目力观察，判断荧光的强度一 般分为四级：“0”无或可见微弱荧光；“+”仅能见明 确可见的荧光；“++”可见有明亮的荧光；“+++”可见
耀眼的荧光，这种判断方法带有很大的主观性。LSCM 借助免疫荧光标记方法，与激光扫描、光学显微镜、计 算机技术相结合，可对细胞内荧光标记的物质进行定性、 定量监测。通过后期处理可对单标记或多标记的细胞或 组织标本的荧光进行定量分析，同时还可将荧光像与定 量图形重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。借助 光学切片的功能可在毫不损失分辨率的条件下，测量标 本深层的荧光强度，使实验数据更加充分和真实可靠。
1024型LSCM配置的是Zeiss Axiovert 100型倒置显微镜。 镜头倍率和数值孔径是固定的。
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4．计算机及界面
（1）计算机：硬件，内存32MB，硬盘12GB；软件，
用于图像采集和分析的OS/2，Window5.0等和测定钙离子 的Time-Course/Ratiometric等软件。
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五、影响荧光组织细胞染色的因素
荧光染料是否发射荧光或荧光的强弱，主要决定于该
染料的分子结构。同时，与它所处的环境及其状态也有密 切关系，如 :
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四、染色和封固 LCSM 一般采用免疫荧光染色，具体方法参见荧 光染色的有关章节。注意染色后要尽快观察，切片要 避光保存。
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封固常用甘油和0.5mol/L pH9.0~9.5的碳酸盐缓冲 液的等量混合液。由于激光共聚焦显微镜观察采集图 象很快，所以一般用 PBS 或生理盐水也可以。如需将
染色后的样品保存一段时间，可以用指甲油在盖玻片 周围封闭，暗处保存。