分子印迹
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19
蛋白质印迹的技术障碍
• 印迹反应体系
具体要求： （1）接近于生理溶液条件（pH,离子强度,温度） （2）不与蛋白质表面基团发生交叉反应
20
蛋白质印迹
D.R. Kryscio Acta Biomaterialia (2012) 8: 461–473
21
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
Shi H Q. Nature, 1999, 398:593
An integrated microfluidic device could perform 1024 in situ click chemistry reactions in parallel using the carbonic anhydrous II.
J Am Chem Soc. 2005, 127(18):6686-92.
分子印迹技术
技术原理
分子印迹是指针对某一特定分子制备具有选择性识别能力的聚合物 的技术。
潜在优势：
研究思想——人工合成与模板分子空间结构契合、作用力类型匹 配的聚合物材料。
发展历程
• 1894年，Fischer 建立锁匙模型理论（理论基础） • 1940年，Panling 提出“合成抗体”的理念 （萌芽） • 1993年，Mosbach 在Nature上发表了关于茶碱分子印迹
35
36
点击化学 (Click chemistry)
37
点击化学
Many heteroatom reactions click together in a predictable way
Barry Sharpless Nobel laureate, Scripps Institute, US
Click sense——large thermodynamic driving force , mild reaction conditions
聚合物的报道（取得实质进展）
每年论文发表数量
3
分子识别的作用力基础
分子识别——以分子间非共价作用（静电、氢键、范德华力、ππ共轭、金属螯合以及熵驱动的疏水效应等）为核心。
共价键 键能 C-H：414 kJ/mol C═O：728 kJ/mol 离子键 晶格能
CuCl：929 kJ/mol
NaCl：777 kJ/mol
38
反应策略
Michael addition of thiols
39
反应策略
Cycloaddition between Azides and Alkynes
叠氮化合物和炔烃分子小，不能形成强氢键，极性相对弱，对连 接在其上的其他结构的性质没有显著影响，且都可以很容易地引入到 有机化合物中；对亲核试剂、亲电试剂和一般的溶剂均表现出惰性， 几乎完全不与生物分子发生反应。
Lab Chip. 2009, 9(16):2281-5
44
基于活性聚合与点击化学 的分子印迹策略
45
研究构想示意图
功能化分子刷在蛋白质表面原位点击交联
46
The End
Q&A Time !
47
Cutivet A, J Am Chem Soc (2009) 131:14699
24
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
蜂毒（Melittin）
—— 26 肽
Yu Hoshino J. Am. Chem. Soc. 2008, 130：15242
25
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
Yu Hoshino J. Am. Chem. Soc. 2010, 132：6644
13
蛋白质分子印迹
14
蛋白质结构特征
分子体积大 分子结构依赖于水分子维系 构象灵活 活性官能团较多
15
蛋白质印迹的技术障碍
• 传质问题
16
蛋白质印迹的技术障碍
• 构象不稳定
反应体系的不利因素1：引发条件
紫外线对核糖核酸酶二级结构的影响
——远紫外（左）和近紫外（右）圆二色图谱
Tan, Langmuir (2007) 23: 2725
26
蛋白质印迹方法
表面印迹与化学传感器耦合
基于多元酚的氧化自聚反应
Nat Nanotechnol. 2010 5(8):597-601
27
蛋白质印迹方法
• 标签印迹
肽标签——AYLKKATNE, GRYVVDTSK and VVSTQTALA.
Average KD for Cyt c of 72.3 nM
17
蛋白质印迹的技术障碍
• 构象不稳定
反应体系的不利因素2：反应助剂的使用
SDS（0.3 w/V%）对核糖核酸酶二级结构的影响
——远紫外（左）和近紫外（右）圆二色图谱
18
Tan, Langmuir (2007) 23: 2725
蛋白质印迹的技术障碍
• 作用力形式
氢键作用受水分子干扰严重
水溶液体系中需要更多的依赖静电或疏水等作用形式
4
分子识别的作用力基础
氢 键
静电作用
π-π 作用
5
分子识别的作用力基础
金属螯合作用
6
分子识别的作用力基础
疏水作用
自由基聚合反应
引发
链增长
链终止
8
印迹反应体系
• 引发条件：引发剂——过氧化物类、偶氮类
引发条件——紫外光引发、热引发
• 单体/交联剂
• 溶/助剂：溶剂、表面活性剂、致孔剂
9
分子印迹产物形貌
多孔结构有利于传质
10
MIP应用现状
目前，针对小分子化合物（分子量小于1500 Da）的印迹 技术已趋于成熟并实现了商业化应用。
专注于小分子印迹定制业务的公司： • MIP Technologies AB (Lund, Sweden), • POLY Intell (Val de Reuil, France), • MIP Solutions Inc. (Washington, USA)，
40
分子偶联41交联结构来自42原位点击化学
在酶表面原位交联与其紧密结合的前导化合物，筛选和制备多价高 亲和抑制剂——该应用被称为蛋白质表面的原位点击化学。
43
The new inhibitors with Kd as low as 33 fmol, are the most potent noncovalent AChE inhibitors known.
Nishino H Angew Chem Int Ed (2006) 45:2392
28
Summary
针对蛋白质分子的特点，在技术上，发展：
有利于大分子传质的印迹方式；
选取适用于生理条件的作用力载体； 寻找―生物分子友好‖的反应体系在水溶液中引发条件 温和的交联或聚合反应，是实现蛋白质高效印迹的重要前 提。 目前，表面印迹技术基本解决了大分子印迹的传质问 题，化学反应体系仍然是限制蛋白质分子印迹技术成功应 用的主要制约因素。
• Semorex (NJ, USA).
11
应用领域
• • • • • 手性分离 固相萃取 催化 药物载运 高效毛细管电泳
12
MIP-HPLC分离药物中间体
（1）分子印迹聚合物（MIP）装填的HPLC色谱柱。（2）D，L-邻氯扁桃 酸在MIP固定相上的HPLC分离图。（3）表面接枝聚合制备的分子印迹微 球固定相。（4）分子印迹薄膜结合不同浓度底物前后的SPR谱图。
22
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
23
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
Molecular imprinting of trypsin using a polymerizable inhibitor as an anchoring monomer
Competitive inhibition constant Ki of 79 nM
29
原子转移自由基反应
(Atom Transfer Radical Polymerization, ATRP)
30
ATRP
• 原理:
31
32
33
聚丙烯酸正丁酯接枝
单壁碳纳米管
硅纳米颗粒
Fe3O4 磁性纳米 颗粒
Nature chemistry ,2009,1:275
34
ATRP 制备可降解纳米凝胶颗粒
蛋白质印迹的技术障碍
• 印迹反应体系
具体要求： （1）接近于生理溶液条件（pH,离子强度,温度） （2）不与蛋白质表面基团发生交叉反应
20
蛋白质印迹
D.R. Kryscio Acta Biomaterialia (2012) 8: 461–473
21
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
Shi H Q. Nature, 1999, 398:593
An integrated microfluidic device could perform 1024 in situ click chemistry reactions in parallel using the carbonic anhydrous II.
J Am Chem Soc. 2005, 127(18):6686-92.
分子印迹技术
技术原理
分子印迹是指针对某一特定分子制备具有选择性识别能力的聚合物 的技术。
潜在优势：
研究思想——人工合成与模板分子空间结构契合、作用力类型匹 配的聚合物材料。
发展历程
• 1894年，Fischer 建立锁匙模型理论（理论基础） • 1940年，Panling 提出“合成抗体”的理念 （萌芽） • 1993年，Mosbach 在Nature上发表了关于茶碱分子印迹
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36
点击化学 (Click chemistry)
37
点击化学
Many heteroatom reactions click together in a predictable way
Barry Sharpless Nobel laureate, Scripps Institute, US
Click sense——large thermodynamic driving force , mild reaction conditions
聚合物的报道（取得实质进展）
每年论文发表数量
3
分子识别的作用力基础
分子识别——以分子间非共价作用（静电、氢键、范德华力、ππ共轭、金属螯合以及熵驱动的疏水效应等）为核心。
共价键 键能 C-H：414 kJ/mol C═O：728 kJ/mol 离子键 晶格能
CuCl：929 kJ/mol
NaCl：777 kJ/mol
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反应策略
Michael addition of thiols
39
反应策略
Cycloaddition between Azides and Alkynes
叠氮化合物和炔烃分子小，不能形成强氢键，极性相对弱，对连 接在其上的其他结构的性质没有显著影响，且都可以很容易地引入到 有机化合物中；对亲核试剂、亲电试剂和一般的溶剂均表现出惰性， 几乎完全不与生物分子发生反应。
Lab Chip. 2009, 9(16):2281-5
44
基于活性聚合与点击化学 的分子印迹策略
45
研究构想示意图
功能化分子刷在蛋白质表面原位点击交联
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The End
Q&A Time !
47
Cutivet A, J Am Chem Soc (2009) 131:14699
24
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
蜂毒（Melittin）
—— 26 肽
Yu Hoshino J. Am. Chem. Soc. 2008, 130：15242
25
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
Yu Hoshino J. Am. Chem. Soc. 2010, 132：6644
13
蛋白质分子印迹
14
蛋白质结构特征
分子体积大 分子结构依赖于水分子维系 构象灵活 活性官能团较多
15
蛋白质印迹的技术障碍
• 传质问题
16
蛋白质印迹的技术障碍
• 构象不稳定
反应体系的不利因素1：引发条件
紫外线对核糖核酸酶二级结构的影响
——远紫外（左）和近紫外（右）圆二色图谱
Tan, Langmuir (2007) 23: 2725
26
蛋白质印迹方法
表面印迹与化学传感器耦合
基于多元酚的氧化自聚反应
Nat Nanotechnol. 2010 5(8):597-601
27
蛋白质印迹方法
• 标签印迹
肽标签——AYLKKATNE, GRYVVDTSK and VVSTQTALA.
Average KD for Cyt c of 72.3 nM
17
蛋白质印迹的技术障碍
• 构象不稳定
反应体系的不利因素2：反应助剂的使用
SDS（0.3 w/V%）对核糖核酸酶二级结构的影响
——远紫外（左）和近紫外（右）圆二色图谱
18
Tan, Langmuir (2007) 23: 2725
蛋白质印迹的技术障碍
• 作用力形式
氢键作用受水分子干扰严重
水溶液体系中需要更多的依赖静电或疏水等作用形式
4
分子识别的作用力基础
氢 键
静电作用
π-π 作用
5
分子识别的作用力基础
金属螯合作用
6
分子识别的作用力基础
疏水作用
自由基聚合反应
引发
链增长
链终止
8
印迹反应体系
• 引发条件：引发剂——过氧化物类、偶氮类
引发条件——紫外光引发、热引发
• 单体/交联剂
• 溶/助剂：溶剂、表面活性剂、致孔剂
9
分子印迹产物形貌
多孔结构有利于传质
10
MIP应用现状
目前，针对小分子化合物（分子量小于1500 Da）的印迹 技术已趋于成熟并实现了商业化应用。
专注于小分子印迹定制业务的公司： • MIP Technologies AB (Lund, Sweden), • POLY Intell (Val de Reuil, France), • MIP Solutions Inc. (Washington, USA)，
40
分子偶联41交联结构来自42原位点击化学
在酶表面原位交联与其紧密结合的前导化合物，筛选和制备多价高 亲和抑制剂——该应用被称为蛋白质表面的原位点击化学。
43
The new inhibitors with Kd as low as 33 fmol, are the most potent noncovalent AChE inhibitors known.
Nishino H Angew Chem Int Ed (2006) 45:2392
28
Summary
针对蛋白质分子的特点，在技术上，发展：
有利于大分子传质的印迹方式；
选取适用于生理条件的作用力载体； 寻找―生物分子友好‖的反应体系在水溶液中引发条件 温和的交联或聚合反应，是实现蛋白质高效印迹的重要前 提。 目前，表面印迹技术基本解决了大分子印迹的传质问 题，化学反应体系仍然是限制蛋白质分子印迹技术成功应 用的主要制约因素。
• Semorex (NJ, USA).
11
应用领域
• • • • • 手性分离 固相萃取 催化 药物载运 高效毛细管电泳
12
MIP-HPLC分离药物中间体
（1）分子印迹聚合物（MIP）装填的HPLC色谱柱。（2）D，L-邻氯扁桃 酸在MIP固定相上的HPLC分离图。（3）表面接枝聚合制备的分子印迹微 球固定相。（4）分子印迹薄膜结合不同浓度底物前后的SPR谱图。
22
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
23
蛋白质印迹方法
• 表面印迹
Molecular imprinting of trypsin using a polymerizable inhibitor as an anchoring monomer
Competitive inhibition constant Ki of 79 nM
29
原子转移自由基反应
(Atom Transfer Radical Polymerization, ATRP)
30
ATRP
• 原理:
31
32
33
聚丙烯酸正丁酯接枝
单壁碳纳米管
硅纳米颗粒
Fe3O4 磁性纳米 颗粒
Nature chemistry ,2009,1:275
34
ATRP 制备可降解纳米凝胶颗粒