逆流色谱原理简介

逆流色谱原理简介
任何熟悉液液萃取（使用分液漏斗）和色谱（例如HPLC）技术的人都很容易理解逆流色谱液液萃取的原理(countercurrentchromatography(CCC))。

液液萃取为化学家们分离大量的化学物质提供了一个简单的方法，而且使用的溶剂最少。

把样品溶在两相溶剂系统中，振摇使两相充分混合，静置后，两相重新分层。

这些步骤是分离样品组分的关键。

这种经典的液液萃取在色谱工作者看来，最大的缺点是它在分离过程中只有一个理论塔板数。

（事实上，这种情况下没什么理论可言。

这一个分离塔板数是源自于工业上的分馏。

因此，化学工作者要么设计一合适的单步分离方法去适应自己的需要，要么就用多次液液萃取去提高分离度。

通常使用前者，因为后者太麻烦了。

（尽管多次液液萃取经常用到，但溶剂系统在不同的提取中通常要改变，以便提高效率。

）为了改善分液漏斗，以经过许多的尝试。

克雷格逆流分布仪是其中一个最引人注意的突破。

这套精妙的仪器，把一系列的分液漏斗有效的排成链，重复的进行系列的步骤：振摇（混合）、静置、分离，再重头开始，这样就提高了塔板数。

假如有足够的塔板数，那这套仪器可以达到色谱级的分离。

液滴逆流色谱（DCCC）
在发展过程中又开发出了液滴逆流色谱（DropletCounterCurrentChromatograph）。

这个仪器把一系列垂直的管子用毛细管连接起来。

液体固定相留有直管中，把流动相慢慢的泵进去，（如果流动相比较重就从上方泵进去；反之，则从下方）。

象所有的色谱那样，组分比较容易溶于流动相中的就移动的快；而比较容易溶于固定相中就滞后了。

于是就分离开来了。

很显然，每一个直管只有最小可能的理论塔板数。

所以，要有显著的效能就要用大量这样的直管。

其分离步骤如下：把样品液滴与流动相混合，通过不移动的固定相，期间没有发生振摇。

液滴的大小与其他溶剂系统的参数限制了溶质在两质中的分配。

静置最终在直管末端形成，在这儿，流过固定相的流动相在通过毛细管进入下一根直管前先聚集起来。

如果流速过高就会干扰静置并破坏了分离。

通过毛细管，流动相从一个直管流入下一个直管，达到分离的目的。

DCCC最大的弱点是可允许的流速太低，因此分离时间长，两相混合差，相对来说，造成效率就低了。

离心液滴逆流色谱（centrifugalDCCC，entrifugalplanetarychromatograph,CPC）比DCCC进步的地方就是使用离心加快重力分离。

离心液滴逆流色谱更通用的叫法是离心行星色谱，使用很小的直管和毛细管（用多性塑料制成多层的）。

一套实用的仪器包含数以千计的直管，可以获得几百个理论塔板数的效能。

CPC的缺点和DCCC相似，只是用离心代替了地球重力分离。

另外，CPC还多了个缺点，就是它在流动相的进口和出口必须使用旋转流体密封件；而这些密封件性能不好，价格又高，容易损耗，并且限制了泵液的压力，进而限制了流速和离心速度。

高速逆流色谱（High-SpeedCountercurrentChromatography,HSCCC）
现代的CCC源于Dr.YoichiroItod（国家健康研究中心）的研究：行星离心分离机，及其能支持的许多可能的柱几何学。

这些巧妙的仪器运用了鲜为人知的离心分离机定子与转子非旋转连接的方法。

（这超出了当前的讨论范围，涉及到如何达到这一目的的方法，任何一本讨论CCC的书对此都有详细的阐述）。

功能上，高速逆流色谱有能自转和公转的螺旋盘绕的惰性管（既进行绕自轴旋转的行星式旋转，又同时进行绕公轴旋转。

）组成。

自轴和公轴（像行星自轴和恒星的公轴）必须同步，这里的讨论只集中于不同HSCCC的共同的地方。

这两种旋转造成螺旋盘绕管中作令人昏乱的运动的液体产生混合区和静置分层区。

这就为色谱形成造就了非常好的分离环境。

高速逆流色谱（ high-speed countercurrent chromatography ， HSCCC ）是 20 世纪 80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体。

它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。

由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。

而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。

它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。

目前HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术；适合于中小分子类物质的分离纯化。

仪器的中心部分：(a) ITO多层线圈分离柱，它是由100-200米长、内径为1.6mm 左右的聚四氟乙烯管沿具有适当内径的内轴共绕十多层而成，其管内总体积可达300mL左右。

(b)平衡器，它可以调节重量，它的作用是让(a)，(b)相对于中心轴两边重量平衡。

当在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置作用下，(a)，(b)同时绕中心轴作顺时针或反时针的行星运动，即(a)- (b)本身既在自转，但同时又在绕中心轴公转，公转转速可从0-4000r/min。

从线圈分离柱中通过中空的中心轴还同时牵引出了线圈的两端，一端供泵入液用，一端输出液体。

仪器工作需要互不相溶的两种液体，一相作固定相，一相作移动相。

仪器工作前，先将作为固定相一相的液体通过恒流泵压入线圈分离柱，然后用进样器将待分离的样品按如图所示进样，最后用恒流泵压入移动相，同时启动中心部分运转直到转速大于600r/min。

此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动之势。

由于移动相源源不断的压入，阻止了固定相的流出，同时，移动相带着样品在线圈分离柱中进行无限次的分配而使复杂样品得到分离。

当移动相经过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同大小的信号，用记录仪就能得到逆流色谱图谱，同时用馏分收集器分步收集移动相就会得到复杂样品被分开的组分。

较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型的HSCCC 柱容积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力堪与HPLC 相媲美。

应用范围广，适应性好
由于溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。

由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体不需要固相载体，因而可以消除固-液色谱中由于使用固相载体而带来的吸附损失，特别适用于分离极性物质。

操作简便，容易掌握
仪器操作简单，对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行的制备分离或分析。

回收率高
不需要固相载体，消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品的回收率可达。

在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。

重现性好
如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都保持很稳定，而且重现性相当好。

分离效率高，分离量较大
由于其与一般的色谱分离方式不同，能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大。

分配系数
溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分离的关键所在，而样品中各组分的分配系数决定着这种溶剂系统是否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。

目前，分配系数的测定多采用薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。