第二章 色谱法的基本原理
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天然药物化学第二章,第三节,色谱分离
薄层色谱的操作技术流程
铺
板
点
样
展
开
计算比移值
显色与定位
二、吸附色谱法
（五）操作技术 1.薄层色谱法 步骤：制板→点样→展开→显色→Rf值计算
43
操作步骤
（1）软板的制备
软板：直接将吸附剂(我们有哪些吸咐剂）铺在玻璃板上制 成，不加粘合剂 要求：厚度→随分离要求而定，一般0.25～0.5mm 玻璃棒推动速度不宜过快、也不应停顿→影响厚度均一性
5
植物色素分离图示
一、分离原理和基本概念：
色谱法： 是利用混合物中各成分在 流动相和固定相之间的 作用力和亲和力（吸附， 分配，离子交换、分子 筛）的不同，在两相中 作相对移动时，混合物 中各种成分随流动相运 动速度不同，从而达到 相互分离的方法。
7
8
色谱分离
慢 中等 快
淋洗液
Temporal course
适用范围
酸性成分：氨基酸、有机酸； 对酸稳定的中性成分 生物碱、甾体、强心苷
备注
不适用：醛、 酮、酯、内酯 类成分
中性成分：醛、酮、皂苷、萜 中性 6.5~7.5 类
★
27
常用吸附剂
2.硅胶（应用最多★） 吸附能力决定于硅羟基数，吸附活性取决于含水量。
OH Si O O Si O O O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O O OH Si O Si O O O
炭。
二、吸附色谱法
（二）吸附剂（固定相） 选择合适的吸附剂是吸附色谱法成功的关键。★ 良好的吸附剂应具备： ①不与样品及流动相发生化学反应 ②不溶于流动相 ③具有较大的表面积和一定的吸附能力。 ④具有一定的细度，颗粒要均匀。
第二章 气相色谱法(2)
二、塔板理论
最早由Martin等人提出塔板理 论，把色谱柱比作一个精馏塔， 沿用精馏塔中塔板的概念来描述 组分在两相间的分配行为，同时
引入理论塔板数作为衡量柱效率
的指标。
该理论假定：
（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平
衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。 （ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的， 而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。 （iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴 （纵）向扩散可忽略。
m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。 当V=Vr 时，C值最大，即
Cmax
n m 2 Vr
由流出曲线方程可推出：
tr 2 tr 2 n 5.54( ) 16( ) W1/2 W
而理论塔板高度（H）即：
L H n
从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越
小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。
分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故
nm=ns=0.5。当一个板体积（lΔV）的载气以脉动形式进入0 号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上， 此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm 部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总 量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所 含总量同样为0.5．气液（或气固）相亦各为0.25。以后每
三、速率理论
1956年荷兰学者van Deemter等在研究气液色谱时，提出
了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理 论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传 质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的 各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。 van Deemter方程的数学简化式为
第二章色谱基础理论(本)
基础理论
46
基础理论
47
范氏方程说明：
▪ u一定时，A，B，C越小，H越小，柱效越
高，色谱峰越窄；颗粒越小，H越小，柱 效越高。
▪ U很小时，B/U项占主导，CU项可忽略 ▪ U很大时，CU项占主导，B/U项可忽略
基础理论
48
综合考虑: U实际稍高于Uopt 因为: 1.右侧曲线斜率小,U稍变化不会引起
拖尾因子（fs） x = h/20
fs =（B+A）/2A
fs = 0.95-1.05 正常峰
fs <0.95
前延峰
fs >1.05
拖尾峰
即使不进样也会出现的峰
20% - 100% MeOH
60
没有进样
15
30
问题:流动相脏
15
0
3
7
15
17
基础理论
13
二、定 性 参 数
W
(t tR )2
e 2 2
V 2
---呈正态分布 t=tR时，C=Cmax
基础理论
31
Cmax的影响因素：
进样量W愈大,则Cmax愈大，W与Cmax 成正比。 色谱柱内径愈小，填充愈紧密，Cmax/W比值愈
大。即柱愈细填充愈紧密，柱效N越高。 色谱柱愈短，Cmax值愈大。 先出柱的组分k’小，所以Cmax/W大。提高柱温 （GC），增加强洗脱剂的浓度（HPLC），可使
总结
●热力学：保留值的差 别要足够大 Sig
●动力学：色谱峰要
足够窄
Sig
基础理论
time time time 51
第四节 分子间作用力
基础理论
52
一、定向力
第二章色谱法应用基础薄层色谱
❖ 5、名词解释： 吸附色谱 分配色谱
按照吸附剂（固定相）分类 TLC可分为
❖ 吸附薄层色谱
是以吸附剂（固定相）和被分离物之间的吸附作 用为基础进行样品分离的形式
❖ 分配薄层色谱
利用被分离物在流动相和固定相的相对极性差异 来分离的形式
吸附薄层色谱和分配色谱的主要特点
方法
吸附薄层法 正相分配薄 反相分配薄
层色谱
层色谱
主要分离对 象
疏水（亲脂）亲水无机物、相似的疏水 弱极性或中 亲水极性有 物质 等极性有机 机物 化合物
2.2.4 TLC展开方式
❖ 上行展开 ❖ 下行展开 ❖ 一次展开 ❖ 二次展开 ❖ 单向展开 ❖ 双向展开 ❖ 径向展开
2.2.5 TLC显色方法
❖ a 芳胺类
1）化学法
❖ Ehrlich试剂
1,2-萘醌-4-磺酸
❖ 菲醌（主要用于邻苯二胺类）
❖ 茚三酮（用于鉴定脂肪胺、氨基酸等） ❖ 如L-丙氨酸、甲酯、（S）-2-氨基丙醇等鉴定
❖ 亲水性混合物TLC用固定相
纤维素、硅藻土、聚酰胺和离子交换树脂
常用TLC吸附剂
❖ 硅胶（Silica Gel） ❖ 多孔网状结构的中性或弱酸性吸附剂，适用
于酸性及中性物质的分离（大部分有机物均 可），碱性化合物能与硅胶作用，拖尾或无 法展开
❖ 氧化铝 ❖ 可用于碱性或中性化合物的分离
❖ 纤维素 ❖ 亲水性强，用于亲水性化合物的分离
一般有机物的极性由小到大排列顺序
❖饱和烃＜不饱和烃＜醚＜酯 ＜醛、 酮 ＜胺 ＜羟基化合物＜酸 ＜离子 化合物（如R+NH3， RCOO-等）
2）常用吸附剂的吸附能力
❖ 蔗糖＜纤维素 ＜淀粉＜碳酸钙 ＜硫酸钙 ＜ 碳酸镁 ＜硅胶＜活性炭 ＜氧化镁 ＜三氧化 二铝
第2章-色谱基本理论a-塔板理论
选择因子
在定性分析中， 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标 ），然后再求其它峰 然后再求其它峰（ 准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对 保留值．在多元混合物分析中， 保留值．在多元混合物分析中，通常选择一对最 难分离的物质对， 难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要 参数．在这种特殊情况下，可用符号α表示： 参数．在这种特殊情况下，可用符号α表示：
4．死体积 VM
指色谱柱在填充后， 指色谱柱在填充后 ， 柱管内固定相颗 粒间所剩留的空间、 粒间所剩留的空间 、 色谱仪中管路和连接 头间的空间以及检测器的空间的总和． 头间的空间以及检测器的空间的总和 ． 当 后两项很小而可忽略不计时， 后两项很小而可忽略不计时 ， 死体积可由 死时间与流动相体积流速F min） 死时间与流动相体积流速 F0 （ L ／ min ） 计 算：
一、分配系数K和分配比k 一、分配系数K和分配比k
1．分配系数K ．分配系数K
色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间 反复多次地分配或吸附--脱附过程。 --脱附过程 反复多次地分配或吸附--脱附过程。 分配系数是描述分离过程中样品分子在两相间分配 的参数，它是指在一定温度和压力下， 的参数，它是指在一定温度和压力下，组分在固 定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值
L u = tm
保留时间t 2．保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大 点时所经历的时间，称为保留时间， 点时所经历的时间，称为保留时间，如 O′B． 图2-1 O′B．它相应于样品到达柱末端 的检测器所需的时间． 的检测器所需的时间．
图2-1 色谱流出曲线
3．调整保留时间tR′ 调整保留时间t
2—3 色谱法分析的基本原理 3
目的：将样品中各组分彼此分离， 目的：将样品中各组分彼此分离，组分要达到完 全分离，两峰间的距离必须足够远. 全分离，两峰间的距离必须足够远. 两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定 即与色谱过程的热力学性质有关。 热力学性质有关 的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰 间虽有一定距离，如果每个峰都很宽， 间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此 重叠，还是不能分开。 重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分 在色谱柱中传质和扩散行为决定的， 在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过 程的动力学性质有关。因此， 动力学性质有关 程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力 学两方面来研究色谱行为。 学两方面来研究色谱行为。
第二章 色谱法的原理
按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随 着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一 板上的总量（气液两相中的总质量）,由塔板理论可建流 出曲线方程：
C
m n V 2 exp[ (1 ) ] 2 Vr 2 Vr
n
m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。 当流动相体积V=Vr 时，C值最大，即
分离度和柱效率
理论需要解决的问题：
塔板理论和速率理论都难 以描述难分离物质对的实 际分离程度。即柱效为多 大时，相邻两组份能够被 完全分离。
难分离物质对分离度的大 小受色谱过程中两种因素 的综合影响：
保留值之差──色谱 过程的热力学因素； 区域宽度──色谱过 程的动力学因素。
色谱分离中的四种情况：
① 柱效较高，△K(分配系数)较 大,完全分离； ② △K不是很大，柱效较高，峰 较窄，基本上完全分离； ③ △K较大,柱效较低，但分离的 不好； ④ △K小，柱效低，分离效果更 差。
分离度：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽 总和之半的比值，（设W1=W2） 当R＜1时，两峰有部分重叠； 当R＝1时，分离程度可达98％；
分配系数K与分配比k的关系
cs ms / Vs Vm K k k cm mm / Vm Vs
相比率β：反映各种色谱柱型特点的参数 例如：填充柱，其β值一般为6～35； 毛细管柱，其β值为60～600。
二、 塔板理论（plate
theory）
最早由Martin等人提出塔板理论，把色 谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板 的概念来描述组分在两相间的分配行为， 同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指 标。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
P307~311
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
仪器分析第二章思考题详解
2．内标法 当只需测定试样中某几个组份．或试样中所有组份不可能全 部出峰时，可采用内标法．具体做法是：准确称取样品，加入一定量某 种纯物质作为内标物，然后进行色谱分析．根据被测物和内标物在色谱 图上相应的峰面积(或峰高）)和相对校正因子．求出某组分的含量． 内标法是通过测量内标物与欲测组份的峰面积的相对值来进行计算的， 因而可以在一定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差． 内标法的要求是：内标物必须是待测试样中不存在的；内标峰应与试 样峰分开，并尽量接近欲分析的组份． 内标法的缺点是在试样中增加了一个内标物，常常会对分离造成一定的 困难。
22.分析某种试样时，两个组分的相对保留值r21=1.11, 柱的 有效塔板高度H=1mm，需要多长的色谱柱才能完全分离？ 解：根据公式
1 R= 4
L 1 ( ) H eff
得L=3.665m
25. 丙烯和丁烯的混合物进入气相色谱柱得到如下数据：
组分 空气 丙烯(P) 丁烯(B)
保留时间/min 0.5 3.5 4.8
7. 当下述参数改变时: (1)增大分配比,(2) 流动相速度增加, (3) 减小相比, (4) 提高柱温,是否会使色谱峰变窄?为什么? 答:(1)保留时间延长,峰形变宽
(2)保留时间缩短,峰形变窄
(3)保留时间延长,峰形变宽 (4)保留时间缩短,峰形变窄
8.为什么可用分离度R作为色谱柱的总分离效能指标?
该法的主要优点是：简便、准确；操作条件(如进样量，流速等)变化 时，对分析结果影响较小．这种方法常用于常量分析，尤其适合于进样 量很少而其体积不易准确测量的液体样品．
20.在一根2 m长的色谱柱上,分析一个混合物,得到以下数据:苯、 甲苯、及乙苯的保留时间分别为 1 ’ 20 “ , 2 ‘ 2 ”及 3 ’ 1 “ ；半峰宽为 0.211cm, 0.291cm, 0.409cm，已知记录纸速为1200mm.h-1, 求 色谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板高度。
色谱概论1-3章
气相色谱图
二、色谱流出曲线的意义： 从色谱图上可获得的信息有： 色谱峰的个数，可判断样品中所含组份的最少个数； 色谱峰的保留值，可进行定性分析； 色谱峰的峰高或峰面积，可进行定量分析；
色谱的保留值或区域宽度，是评价色谱柱分离性能的
色谱峰间距是固定相或流动相选择是否合适的依据。
依据；
a.死时间(tM) ：不与固定相作用的物质从进样到出现 峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。 由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的 流速相近。如用热导池检测器时，从注射空气样品到空气峰 顶出现时的时间。 b.保留时间（tR）：试样从进样到出现峰极大值时的时
间。它包括组份随流动相通过柱子的时间tM和组份在固定相
第三节 色谱法的定义与分类
一、色谱法的定义
色谱法或色谱分析也称之为层析法，是一种物理化学的分 析方法，它利用混合物中各组分在两相间分配系数的差别，当 溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配， 从而使各组分得到分离。分离的仪器即色谱仪。
二、色谱法的分类
色谱法可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。 （一）按流动相与固定相的状态分类 1 ．气相色谱 气相色谱又可分为气固色谱和气液色谱，前者是以气体为 流动相，以固体为固定相的色谱，后者是以气体为流动相，以 液体为固定相的色谱。 2 ．液相色谱 液相色谱又可分为液固色谱和液液色谱，前者是以液体为 流动相，以固体为固定相的色谱；后者是以一种液体为流动相， 以另一种液体为固定向的色谱。
色谱分析
概论
第一章 绪论
第二章 色谱法的原理
第三章 色谱仪
第一章 绪论
1
色谱法的发展简史 色谱法与其他方法的比较和配合
第二章 色谱法原理
保留时间是色谱法定性的基本依 据，但同一组分的保留时间常受到流
动相流速的影响，因此色谱工作者有
时用保留体积来表示保留值。
6. 保留体积VR 指从进样开始到被测组分在柱后出 现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 保留时间与保留体积关系：
VR= tR Fco
7.调整保留体积VR 某组分的保留体积扣除死体积后，称 为该组分的调整保留体积。
以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入 色谱柱时，上述过程就重复一次，如下所示：
塔板号r 进样 q p 0 0.5 0.5 0.25 0.25 0.25 0.25 0.125 0.125 1 2 3
进气1△V q p
进气2△V q 0.125 0.125+0.125 p 0.125 0.125+0.125
色谱图（无铅汽油）
农药
碳酸饮料
2、 区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线 的重要参数之一，用于衡量柱效率及反 映色谱操作条件的动力学因素。表示色 谱峰区域宽度通常有三种方法。
1.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱 峰宽的一半。 2.半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰 宽。它与标准偏差的关系为 Y1/2=2.354 3.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的 切线在基线上截距间的距离。它与标 准偏差的关系是 Y = 4
始于马丁（Martin）和辛格（Synge）
提出的塔板模型。
分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸
点不同而分离。
色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，
按分配系数不同而分离。
板式精馏塔
塔板理论的导出 将色谱分离过程比拟作蒸 馏过程，引用了处理蒸馏过程 的概念、理论和方法来处理色 谱过程。把色谱柱比作一个分 馏塔，色谱柱可由许多假想的 塔板组成（既色谱柱可分成许 多小段），
第2章气相色谱法
对分离较差，峰底宽度难于测量，则用下式表示分离度
R'
tR2 tR1
1 2
(Y12(1)
Y1 2
(
2)
)
20
C
W G
色谱分离基本方程式
体系的热力 学性质
R 1 n ( 1) ( k )
4
k 1
n
(
k
k
1)
2
n有效
R1 4
n有效
( 1)
现现 代代 仪器分析 仪器分析
改变k的方法是：
改变柱温：影响分配系数 改变相比：即改变固定相的量及柱的死体积(采用细颗粒的固定相，
填充紧密且均匀)
分离度与柱选择性的关系
α是色谱柱选择性的量度， α越大，色谱柱选择性越好，分离效 果越好
通过改变固定相，使各组分的分配系数有较大的差别
L
16R
2
(
1)2
17
W CG
现现 代代 仪器分析 仪器分析
B/u分子扩散项：“塞子”前后存在着浓度差
B 2Dg
弯曲因子
气相分子扩散系数
Dg
1
M 载气
摩尔质量大的载气可使B值变小，有利于分离
载气流速愈小，保留时间愈长，分子扩散项的影响也愈 大，从而成为色谱峰扩散的主要因素
18
W CG
现现 代代 仪器分析 仪器分析
调VM整，保或留V体R’=积tRV’·RF’0：指扣除死体积后的保留体积：VR’=VR－
相对保留值r21
指组分2与另一组分1的调整保留值之比。相对保留值只与柱 温及固定相性质有关，与其它色谱操作条件无关，它表示了 色谱柱对这两种组分的选择性： r21相差越大，分离越好。 r21 ＝1，不能分离
第二章第1节 色谱法概述
2010/3/29
1903年，Tsweet 发现色谱分离现象
石油醚 色素混合液 (流动相） 色谱柱
碳酸钙 （固定相）
色带
2010/3/29
植物色素分离图示
2010/3/29
固相萃取
2010/3/29
2.色谱法分类
气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
流体（气体或液体），称为流动相。
2010/3/29
色谱法
当流动相中携带的混合物流经固定相时， 其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组 分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生 的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移 动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡 ，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而 按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检 测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检 测。 ♦ 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础 （动画）
第二章 色谱分析法
第一节 色谱法概述
一、 色谱法的特点、分 类和作用 二、分配系数 K20103/29第一节 色谱法概述
一、 色谱法的特点、分类和作用
1.概述 2.分类 3.特点
二、分配系数 K
2010/3/29
传统的分离方法有： 1. 沉淀法 是利用物质溶解度的不同而进 行分离。 2. 蒸馏法 是利用有机物沸点的差异进 行分离。 3. 萃取法 是利用组分在水相和有机相 （互不相溶）中的分配系数不同进行而 分离。
2010/3/29
2010/3/29
液相色谱
液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固 定相，不同pH值的水溶液为流动相。
1903年，Tsweet 发现色谱分离现象
石油醚 色素混合液 (流动相） 色谱柱
碳酸钙 （固定相）
色带
2010/3/29
植物色素分离图示
2010/3/29
固相萃取
2010/3/29
2.色谱法分类
气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱
流体（气体或液体），称为流动相。
2010/3/29
色谱法
当流动相中携带的混合物流经固定相时， 其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组 分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生 的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移 动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡 ，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而 按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检 测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检 测。 ♦ 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础 （动画）
第二章 色谱分析法
第一节 色谱法概述
一、 色谱法的特点、分 类和作用 二、分配系数 K20103/29第一节 色谱法概述
一、 色谱法的特点、分类和作用
1.概述 2.分类 3.特点
二、分配系数 K
2010/3/29
传统的分离方法有： 1. 沉淀法 是利用物质溶解度的不同而进 行分离。 2. 蒸馏法 是利用有机物沸点的差异进 行分离。 3. 萃取法 是利用组分在水相和有机相 （互不相溶）中的分配系数不同进行而 分离。
2010/3/29
2010/3/29
液相色谱
液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固 定相，不同pH值的水溶液为流动相。
第二章气相色谱分析
流出曲线方程
• C0为进样浓度；tR为保留时间； σ为标准偏差， C为时间t时在柱出口的浓度。
色谱柱长：L，
虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n=L/H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!
有效塔板数和有效塔板高度
• 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 • 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 • 组分在 tM 时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数 和有效塔板高度：
Cg 0.01k (1 k )
2
dp
2
Dg
液相传质阻力系数Cl为
由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的 扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。降低固定液的 含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使 C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比 表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的 载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成 拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大Dl，但会 使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱 温。
2 色谱流出曲线及有关术语
1)．流出曲线和色谱峰
2)、基线
是柱中仅有流动相通过时，检测器响 应讯号的记录值，稳定的基线应该是一条 水平直线。
3)、峰高
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h 表示。
4)、保留值
（1）时间表示的保留值
保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极 大值时所需的时间； 死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气 ）从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时 间; 调整保留时间（tR ＇）：tR＇= tR－tM
滞留因子（retardation factor）：
仪器分析-气相色谱分析
• 3、保留值：是试样各组分在
色谱柱中保留行为的量度，它 反映组分与固定相间作用力大 小，通常用保留时间和保留体 积表示。 死时间tM：不被固定相吸附或 溶解的组分（如空气、甲烷） 从进样到出现其色谱蜂最大值 所需的时间，图中O'A'所示。 保留时间tR ：指某组分通过 色谱柱所需时间，即试样从进 样到出现峰极大值时的时间， 图中Ｏ‘Ｂ所示。 调整保留时间tR’ 死时间后的 保留时间，它是组分在固定相 中的滞留时间。图中A’B所示， 即 tR’ = tR － tM
通常以有效塔板数neff 和有效塔板高度Heff 表示：
neff H eff
t t 2 5.5 4( ) 1 6( )2 W1 / 2 Wb L neff
' R
' R
2-2-3 速率理论
• 塔板理论存在的假定有缺陷,不能解释塔板高度H
受那些因素影响. 1956年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱过程动力学速率理论。 • van Deemter方程：H=A+B/u+C*u u 为流动相线速度； A，B，C 为常数. 其中: A — 涡流扩散系数； B — 分子扩散系数； C — 传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系 数）
• 1、气路系统
• 载气：H2，N2，He，Ar等 • 净化器：提高载气纯度 • 稳压恒流装置，气体流速控制和测量。
• 2、进样系统
• 进样器： 微量注射器、六通阀 • 气化室：瞬间气化，死体积尽可能小
• 3、分离系统
• 色谱柱有填充柱和毛细管柱两大类
2-1-3 组成
• • • • •
4、温控系统 色谱柱、气化室、检测室三处温度控制 气化室温度应使试样瞬间气化但又不分解； 检测器除氢火焰外都对温度敏感； 柱温的变化影响柱的选择性和柱效，因此柱室的 温度控制要求精确，温控反复根据需要可以恒温， 也可以程序升温。
第二章 薄层色谱
3、展开 、 吹干样点， 吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开 瓶中。薄层色谱的展开， 瓶中。薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行 为使溶剂蒸气迅速达到平衡， 。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬 一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂， 一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其 高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析 高度不超过 。 缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。 缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖 观察展开剂前沿上升到一定高度时取出， ，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快 在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位 在板上标上展开剂前沿位置。晾干， 计算Rf值 展开剂要接触到吸附剂下沿， 置，计算 值。展开剂要接触到吸附剂下沿，但 切勿接触到样点。盖上盖子，展开。 切勿接触到样点。盖上盖子，展开。待展开剂上 行到一定高度（由试验确定适当的展开高度）， 行到一定高度（由试验确定适当的展开高度）， 取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。 取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。
第二章 食品分析中常用仪器 检测方法
1
薄层色谱法
一、原理 最常用的薄层色谱也属于液-固吸附色谱 固吸附色谱。 最常用的薄层色谱也属于液 固吸附色谱。吸 附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。 附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。 干燥后在涂层的一端点样 涂层的一端点样， 干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少 量展开剂的的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂 量展开剂的的有盖容器中。 涂层，借毛细作用向上移动。 涂层，借毛细作用向上移动。经过在吸附剂和展 开剂之间的多次吸附 溶解作用， 多次吸附-溶解作用 开剂之间的多次吸附 溶解作用，将混合物中各组 分分离成孤立的样点，实现混合物的分离 分离。 分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。
仪器分析作业题解答
第二章气相色谱法1.简要说明气相色谱分析的基本原理借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离。
气相色谱就是根据组分与固定相与流动相的亲和力不同而实现分离。
组分在固定相与流动相之间不断进行溶解、挥发（气液色谱），或吸附、解吸过程而相互分离，然后进入检测器进行检测。
2.气相色谱仪的基本设备包括哪几部分?各有什么作用?气路系统．进样系统、分离系统、温控系统以及检测和记录系统．气相色谱仪具有一个让载气连续运行管路密闭的气路系统．进样系统包括进样装置和气化室．其作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱前瞬间气化，然后快速定量地转入到色谱柱中．19.有哪些常用的色谱定量方法?试比较它们的优缺点和使用范围?（1）．外标法：外标法是色谱定量分析中较简易的方法．该法是将欲测组份的纯物质配制成不同浓度的标准溶液。
使浓度与待测组份相近。
然后取固定量的上述溶液进行色谱分析．得到标准样品的对应色谱图，以峰高或峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标作峰高或峰面积对浓度的标准曲线．该曲线为一通过原点的直线．分析样品时，在上述完全相同的色谱条件下，取制作标准曲线时同样量的试样分析、测得该试样的响应讯号后．由标谁曲线即可查出其百分含量．此法的优点是操作简单，因而适用于工厂控制分析和自动分析；但结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性．（2）．内标法：当只需测定试样中某几个组份．或试样中所有组份不可能全部出峰时，可采用内标法．具体做法是：准确称取样品，加入一定量某种纯物质作为内标物，然后进行色谱分析．根据被测物和内标物在色谱图上相应的峰面积(或峰高)]和相对校正因子．求出某组分的含量．内标法是通过测量内标物与欲测组份的峰面积的相对值来进行计算的，因而可以在—定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差．内标法的要求是：内标物必须是待测试样中不存在的；内标峰应与试样峰分开，并尽量接近欲分析的组份．内标法的缺点是在试样中增加了一个内标物，常常会对分离造成一定的困难。
2第二章 色谱法概论-速率理论
( R R
1 2
)
2
=ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
n n
1 2
=
L L
1 2
虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。 因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子， 通过降低板高，以提高分离度。
2.分离度与选择因子的关系 2.分离度与选择因子的关系
由基本色谱方程式判断，当α=1时，R=0，这时，无论 怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，α大，选择性好。 研究证明，α的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一 般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有 效增大α值。
A＝2λdp
上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规 则因子λ有关，与流动相的性质、线速变和组分性质无关。 为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且 填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。 因此A＝0。
2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）
纵向分子扩散是由浓 度梯度造成的。组分从柱 人口加入，其浓度分布的 构型呈“塞子”状。如图 18S2所示。它随着流动相 向前推进，由于存在浓度 梯度，“塞子”必然自发 地向前和向后扩散，造成 谱带展宽。分子扩散项系 数为
4.分离度与分析时间的关系 分离度与分析时间的关系
下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系
tr
3 16 R 2 H α 2 (1 + k ) = ) ( u α −1 k 2
从上式，设
16 R 2 H α Q′ = ( )2 u α −1
则可得：
t
r
(1 + k ) ′ = Q k 2
3
tr
(1 + k ) 3 = Q′ k 2
1 2
)
2
=ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
n n
1 2
=
L L
1 2
虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。 因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子， 通过降低板高，以提高分离度。
2.分离度与选择因子的关系 2.分离度与选择因子的关系
由基本色谱方程式判断，当α=1时，R=0，这时，无论 怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，α大，选择性好。 研究证明，α的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一 般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有 效增大α值。
A＝2λdp
上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规 则因子λ有关，与流动相的性质、线速变和组分性质无关。 为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且 填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。 因此A＝0。
2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）
纵向分子扩散是由浓 度梯度造成的。组分从柱 人口加入，其浓度分布的 构型呈“塞子”状。如图 18S2所示。它随着流动相 向前推进，由于存在浓度 梯度，“塞子”必然自发 地向前和向后扩散，造成 谱带展宽。分子扩散项系 数为
4.分离度与分析时间的关系 分离度与分析时间的关系
下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系
tr
3 16 R 2 H α 2 (1 + k ) = ) ( u α −1 k 2
从上式，设
16 R 2 H α Q′ = ( )2 u α −1
则可得：
t
r
(1 + k ) ′ = Q k 2
3
tr
(1 + k ) 3 = Q′ k 2
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β Vm Vs
β：相比
k ms ns csVs K Vs K
mm nm cm Vm
Vm β
分配比的意义：
①k随K和β的变化而变化； ②k值越大→ms越多→柱的容量大
k又称作容量因子。 ③ k是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参 数。
2.2.2 色谱法分离原理
流动相 进样 A+B+空气
定义：
通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积 或时间表示。
特点： 在一定的固定相和操作条件下，任何一种物质都 有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该 组分的定性鉴定。
1．死时间tM
说明：①实际上就是流动相通过色谱柱所需要的
时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。
②tM由色谱柱中流动相体积Vm与流动相流速
色谱法的缺点
定性能力较差。
二、色谱法的重要概念
固定相 流动相 色谱柱
三、色谱法的分类
1、按流动相所处的状态分类
气—固色谱
气相色谱 --- 用气体作流动相
气—液色谱
液—固色谱
液相色谱 --- 用液体作流动相 液—液色谱
超临界流体色谱
2、按固定相使用的形状分类
①柱色谱：固定相装在柱管内。 ②纸色谱 ③薄层色谱 (纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱)
Small Jorgenson等
最先使用薄层色谱法。 用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可 作为流动相（即气相色谱）。
发明了纸色谱。 在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入 实用阶段。
从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。
各种氨基酸
硅胶为载体 水为固定相
年代 1906
1931 1938 1938 1941 1944 1949 1952 1956 1957 1958 1959 1964 1965 1975 1981
发明者
发明的色谱方法或重要应用
Tswett
用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。
Kuhn, Lederer
3. 调整保留时间（ tR ）'
定义：扣除死时间后的保留时间。 tR' = tR tM
说明：组分在固定相中停留的时间。
注意： t t ' t
R
R
M
4. 流动相的流速
定义： 单位时间流动相所通过的距离----线流速，u 单位时间通过流动相的体积-----体积流速，F 单位时间通过流动相的量-----质量流速，Fm和摩尔
Fc
j Tc Tr
Po Pw Po
Fr
压力校正项 湿度校正项 温度校正项
Pi
2
1
3 Po
2
Pi Po
3
1
j
Po Pw Po
Tc Tr
5. 死体积VM
定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需
流动相的体积。
9. 保留值与分配比的关系
被测物在色谱柱内的平均线流速ūx为 流动相在色谱柱内的平均线流速ū为
被测物出现在流动相中的几率为
L u X tR
u L tM
nm ns nm
ūx 与ū 的关系为
uX
u nm ns nm
L为色谱柱长
色谱柱长是一定的，所以
u X tR utM
u
nm ns nm
决定，与被测组分和固定相无关。
2. 保留时间tR
定义：从进样开始到柱后, 组分出现响应信号极大值 时所需时间。
说明：组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时 间。即组分在色谱柱内运行的时间。
影响因素： ①流 动 相——性质、在色谱柱中的体积Vm和流速 ②固 定 相——性质、在色谱柱中的体积Vs； ③被测组分——性质
第二章 色谱法的基本原理
一．教学内容
1. 色谱分离的基本概念和基本原理 2. 色谱分离的理论基础 3. 简单的色谱定性和定量分析的方法
2.1 色谱法概述
2.1.1 色谱法的起源和发展
石油醚 石油醚+植物色素
CaCO3固定相 叶绿素(绿色) 叶黄素(黄色) 胡萝卜素(黄色)
液液分配色谱
水 硅胶
乙醇－氯仿(流动 相)
次恰好为一个塔板体积ΔV。 5. 在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数，即和组
分的量无关。 6. 沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。
假定：K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=1mg
板体积数 （ΔV）
0
1
2
3
0.5 0
0.5
1ΔV
0.25 0.25
0.25 0.25
基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 发明毛细管柱气相色谱。
发表凝胶过滤色谱的报告。 发明凝胶渗透色谱。
发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采 用抑制型电导检测的新型离子色谱法。
创立了毛细管电泳法。
2.1.2 色谱法定义和分类
一、色谱法的定义
流速，Fn) F、Fm和Fn常称作流量。
线流速 l/t (m/min)
F
体积流速v/t (ml/min)
质量流速m/t (g/min)
说明： ① 在流路的任何一点， 质量流速或摩尔流速相等。 Fm=Fn
② 对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同； 对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为
色谱理论
色谱理论需要解决的问题： 影响分离及柱效的因素与提高柱效
的途径，柱效与分离度的评价指标及其 关系 色谱分离过程的热力学和动力学问题。。
2.4 塔板理论
2.4.1 塔板理论的假设
1. 柱分成n段，n为理论塔板数，每段高为H，H为塔板高 度，柱长为L，则n=L/H
2. 所有组分开始都加在第零号塔板上。 3. 在每块塔板上被测物在两相间平衡是瞬间建立的。 4. 流动相是以脉冲式(塞子式)进入色谱柱进行冲洗的，每
tM
1
k
tM
1
K
Vs Vm
表达了保留时间与分配系数或容量因子两个重要 参数的关系。 ① 容量因子越大，溶质的保留时间也越长。 ② 对于混合物，分配系数不等是分离的前提。
例2.1 已知Vs = 2.0 mL，Fc = 50 mL·min-1， tR = 5 min，tM = 1 min。求VM，VR， VR' ，k，K。
tR
utM
nm
tM nm
nm
1
tR ns nm ns nm k 1
nm nm
tR tM (k 1) k tR tM tR'
tM tM
a
t'
R2
t'
R1
t'
R2
tM t'
R1
tM
k2 k1
K2
Vs Vm
K1
Vs Vm
K2 K1
色谱过程方程：
tR
定义：利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之 间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别， 当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次 平衡，使各溶质达到相互分离。
特点： 高超的分离能力，是一种物理化学分析方法
具体优点：
（1）分离效率高。 （2）应用范围广。 （3）分析速度快。 （4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一次完成。 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。
计算：VM = tM F c
6. 保留体积VR
定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号 极大值时所通过的载气体积。
计算： VR = tR Fc
注意：各种保留时间受流动相流速的影响，各种 保留体积与流动相流速无关。
7. 调整保留体积
定义： 保留体积扣除死体积后的体积
计算公式： V ' t ' F V V
分配色谱 (L－L，G－L)
OH Silica base
SO3+N
NH3+
CO2-
OCON(CH3)2
Electrostatic attraction
离子交换色谱 (L－S)
CO2H
空间排阻色谱 (L－S)
2.2 色谱分离原理
2.2.1 分配系数和分配比
1. 分配系数（K）
K Cs Cm
Cs： 被测组分在固定相中的浓度 Cm： 被测组分在流动相中的浓度
Frn
RTr Pr
Frn 为流量计内r处气体Tc Tr
Pr Pc
Fr
柱内平均压力 Pc
Pc
2 3
Pi Po
Pi Po
3
2
1
1
Po
1 j
Po
r点处载气的压力Pr Pr = Po－Pw
12 0.083 0.045
13 0.063 0.05
检测量
0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 流动相体积
2.3 色谱流出曲线
五种磺胺的色谱图
气相色谱分离多环芳烃色谱图
一、色谱流出曲线或色谱图 以检测器对组分的响应信号为纵坐标，流出时间(或流出体 积)为横坐标作图所得的曲线。 R——f (t, V)