遗传与基因工程

4、基因工程简介
基因操作的工具 基因工程的技术路线
基因操作的工具
基因的剪刀——限制性内切酶 基因的针线——DNA连接酶 基因的运载工具——载体
• 限制性内切酶
限制酶是在生物体(主要是微生物)内的 一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切 割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制 性内切酶。
➢ 1910年，美国遗传学家摩尔根
➢ （T.H.M.organ）以果蝇为研究材料， 发现了连锁交换定律并提出遗传粒子 学说，第一次将代表某一特定性状的 基因与某一特定的染色体联系起来， 即基因位于染色体上。
➢ 1944年，美国微生物学家O.T.Avery首 次证实遗传物质的基础是DNA，基因 位于DNA上。
遗传与基因工程
参考教材
基因工程，楼士林等编著，科学出版社，2002.7 基因工程，陆德如等编著，化学工业出版社，2002.7 基因工程原理（上、下册），吴乃虎编著，科学出版
社，2001.9 植物基因工程研究，陈章良主编，北京大学出版社，
1993.5 基因工程学原理，马建岗主编，西安交通大学出版社，
Ampr
Lac promoter
MCS (Multiple cloning sites, 多克隆位点）
pUC18 (3 kb)
lacZ’
ori
噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
噬菌体的溶源生命周期
溶源生长周期： 是指在感染过程中没有产生出子代 噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成 为它的一个组成部分。
1、质粒DNA的构型：
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）
2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：
106~108D
3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：
复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点
质粒DNA的分离与纯化
限制酶
限制 酶
被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
酶切反应系统：
底物DNA
核酸内切限制酶
缓冲液（Tris-HCI、Mg) 温度 (37)
• 基因的针线——DNA连接酶
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝 隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的 断口连接起来，这样一个重组的DNA分 子就形成了。
Eco RⅠ Hind Ⅲ
氨苄青霉素 抗性基因
(ampr)
Pst Ⅰ
pBR322
Bam HⅠ
Sal Ⅰ
抗四性环基素因(terr)
Ori
Ava Ⅰ Pvu Ⅱ
Ampr
Tetr
A pBR322 B
BX B
ori Ampr
B
Amps B
Tets X
X
ori
BB ori
Tetr
pUC质粒载体
人们应用多克隆位点技术， 在pBR322的基础上，组入了一 个在其5’-端带有一段多克隆位点 的lacZ’基因，而发展的具有双功 能检测特性的新型质粒载体系列。
Nonessential region
cos
Exogenous DNA (~20-23 kb)
λ phage
• Viruses that can infect bacteria. •48.5 kb in length •Linear or circular genome (cos ends)
Lytic phase
质粒是基因工程最常用的运载体。 绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA 分子。有的一个细菌中有一个，有的一个 细菌中有多个。
• 大肠杆菌的质粒
最常用的质粒是 大肠杆菌的质粒，其 中常含有抗药基因， 如四环素的标记基因。 质粒的存在与否对宿 主细胞生存没有决定 性作用，但复制只能 在宿主细胞内成。
质粒的生物学特性：
DNA连接酶
1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现 了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯 键的酶，即DNA连接酶。这种酶需要在一条 DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基和在另一 条DNA链5’-末端具有一个磷酸基团，而且还需 要有一种能源分子的存在才能实现这种连接反应。
值得注意的一点是，DNA连接酶并不 能够连接两条单链的DNA分子或环化的单 链DNA分子，被连接的DNA链必须是双 螺旋DNA分子的一部分。
1、氯化铯密度梯度离心法； 2、碱变性法；
1、氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA 链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
溶菌阶段
(Leabharlann Baidu制和释放)
λ phage
48.5 kb in length •Linear or circular genome (cos ends)
溶源阶段
(整合到寄主染色体上)
Protein coat
DNA
λ phage
Long (left) arm
cos
12bp
short (right) arm
孟德尔（1822－1884）
1866年，孟德尔（G.J.Mendel）提出 了遗传因子（hereditary factor）的 概念。他将控制豌豆性状的遗传因 素称之为遗传因子形成了基因的雏 形。
➢ 1909年，丹麦的遗传学家W. Johanssen根据希腊语“给予生命”之 义，创造了“gene”一词。但它只是一 个抽象的单位，并不代表物质实体。
(Replicate and release)
Lysogenic phase
(integrate into host genome)
体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经 过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将
重组DNA导入E.coli细胞内。
λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA （约48.5 kb）的75%~105%。
连接酶反应系统：（类似酶切）
连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37 ℃。但是 在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定 的，尤其是对于那些粘性末端配对碱基数少而且多 为A-T的限制性片段，因此，连接粘性末端的最佳 温度，应该是界于酶作用速率和末端结合速率之间， 一般认为4～15℃比较合适。
载体
分类：
大肠杆菌DNA连接酶：（平末端) T4噬菌体DNA连接酶（平末端、黏性末端）
由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA 分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价 闭合的环形结构。为了克服这一缺点，一般是 用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶，预先处理线 性的载体DNA分子，以移去其末端的5’磷酸基 团。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA 会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变 性。
通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性 染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅 速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程 结果
剪切 → 拼接 → 导入 → 表达 人类需要的基因产物
实质
基因重组
2、生物技术四大支柱
生 物技术 （ 生物工程）
基因工程 细胞工程 酶工程 发酵工程
3、基因
基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序 列的DNA片段。
DNA的结构
原核基因组成
真核基因组成
基因操作的基本步骤
1）提取目的基因 2）目的基因与运载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）重组子的筛选和表达
• 步骤1、提取目的基因
目的基因是人们所需要转移或改造的 基因。
如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种 子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、 干扰素基因等。
2001.11
一、遗传
1、不同研究水平： 个体 （研究内容、变异来源） 分子（微观、人为干预DNA） 群体（宏观、进化）
一 对 容 易 混 淆 的 概 念
杂交在同一物种内进行，转基因技术则 没有限制。
杂交没有人工的基因植入，转基因工程人 工直接改造DNA，更难以控制
2、历史回顾 遗传学之父
1953年Watson和Crick揭示了DNA的双螺旋分子结构
➢1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操 纵元（操纵子）的概念，揭示了原核生 物基因表达调控的重要规律。
➢1972年，重组DNA分子建立，标志着基 因工 程诞生。
基因工程
基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
质粒载体的构建
天然质粒：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。
在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的 天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但 存在一定的局限性。
pBR322质粒载体
“P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字
母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”; “322”表示实验编号。
柯斯质粒载体的特点
1. 具有质粒载体的特性； 2. 具有λ噬菌体的特性； 3. 具有较高容量的克隆能力；
YAC载体：
人基因组十分庞大，约含4×109bp ，建立和筛选人的基因组文库，要求有 容量更大的载体，酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome,YAC）载体 应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（ telesome）、着丝点(centromere)及复 制起点等功能序列，可插入长度达200500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以 随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成 为人基因组研究计划的重要
• 载体必须具备条件
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。
如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应 的基因等。
常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒
• 质粒：
质粒是染色体外能够进行自主复制的 遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌 细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核 以外的DNA分子。
特点：特异性。
即一种限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分 子。
寄主控制的限制与修饰现象
寄主控制的限制与修饰现象，简称R/M体 系，同免疫体系类似，它能够辨别自己的DNA 和外来的DNA，并使后者降解掉。有关寄主控 制的限制与修饰现象的分子生物学研究发现， 它是由两种酶活性配合完成的，一种叫修饰的 甲基转移酶，另一种叫核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶酶切造成的DNA分子的 断裂类型：
➢ 两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地 围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果 形成具有粘性末端的DNA片段；
➢ 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中 心，形成具有平末端的DNA片段。
大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。
寄主控制的限制与修饰是一种广泛的过 程，它的存在有两方面的作用，一是保护自 身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使 之迅速降解。根据限制－修饰现象发现的核 酸内切限制酶，现在已成为重组DNA技术学 的重要工具酶。
基本特性
绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别 由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，这些识 别序列又称核酸内切限制酶的切割位点或靶子序列， 它们有一个共同特点：具有双重旋转对称的结构， 换言之这些核苷酸对的顺序是呈回文结构。
根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选
其他载 体
柯斯质粒载体 YAC克隆载体
柯斯质粒载体
cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用 于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的 cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而 成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克 隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的 cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用 噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌 体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不 会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在 于细胞内。