CoIP原理与方法

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP就是利用抗原蛋白质与抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多,同时由于在非变性条件下进行实验,所以要得到一个完美的实验结果,不仅需要高质量的抗体,同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复

基本实验步骤

(1)收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;

(2) 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体与10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;

(3)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、样品处理:

免疫沉淀实验成功与否,第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上就是处于天然构象状态的抗原与抗体之间的反应,而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量,浓度以及抗原就是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验就是否成功非常关键。在这个环节中,除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外,最为关键的就是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般就是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。我们以常用的RIPA裂解液为例(主要含有pH7、4左右的离子缓冲液,接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂与甘油以及各类蛋白酶抑制剂等)来说明其各主要成份的用途,进而帮助我们如何针对不同的实验目的与不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。

a.缓冲液:离子缓冲液常采用pH7、4的Hepes或者Tris-Cl。

b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要就是因为150 mM接近生理浓度,不会破坏蛋白质之间的相互作用。然而细胞内部的NaCl浓度并不就是均一的,局部NaCl的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl 有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而定。

c.甘油由于其粘性,可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加10%的甘油有助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d.裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜,也同时破坏了许多细胞器的膜,从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀实验的去垢剂作用比较温与,因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自胞质中,主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。

e.去垢剂对于免疫沉淀实验尤其就是免疫共沉淀实验就是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类与不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果:

- 细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。

- 膜蛋白的释放:许多膜蛋白的构象对去垢剂种类与浓度非常敏感,因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验,需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

- 蛋白相互作用:不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样,需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类与浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测,所以一个更为切实可行的办法就就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类与浓度。

二、抗体-agarose beads孵育

裂解细胞,离心并去除不可溶的膜组份后,上清可以储存在-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入Protein A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体与Protein A或者G beads孵育过夜。一般选择

1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1 ug抗体,最高可以添加至5 ug抗体,过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG,但更为妥当的方法就是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如,做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B来做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免Protein A或者G beads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将Protein A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads 孵育。

同时,Protein A或者G beads对不同类型的抗体亲与力不同,结合一抗的种属与Ig亚型,选择合适的Protein A或者G beads也就是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A与Protein G beads的混合物,这样可以达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的烦恼。

三、抗体-agarose beads复合物洗涤:

除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法就是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用与裂解液一样的配方,但去除甘油,以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例,种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然就是进行免疫

共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可以考虑使用低浓度(0、2-0、5%)的SDS洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP: Q&A),而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀,染色质免疫沉淀与RNA-蛋白免疫沉淀),因此,免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加Protein A/G beads与样品孵育,因此在最后离心获得抗体-agarose beads复合物后,eppendorf管中主要含有抗体,目的蛋白,Protein A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中,抗体与目的蛋白以及Protein A/G beads三者之间就是以非共价健结合在一起,只有Protein A/G与agarose beads就是共价结合在一起的。因此,最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去Protein A/G beads后,eppendorf管只有抗体与目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样SDS-PAGE中就含有目的蛋白与抗体二种蛋白,由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)与轻链分子(25KD)。因此,WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外,如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话,还能检测到重链与轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug),所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时,重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

针对上述情况,通常有二种解决办法:

a.选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验与WB实验,这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验,就可以大大减弱重链与轻链分子的WB信号。

b.使用交联剂将抗体与Protein A/G beads交联,然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarose beads复合物,最后离心去除抗体-agarose beads复合物,上清中只留下目的蛋白。

免疫沉淀,免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)与染色质免疫沉淀(Chromation immunoprecipitation,CH

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)就是以抗体与抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,就是确定两种蛋白质就是否在生理条件下有相互作用的

有效方法。其原理就是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋

白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合

的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质就是否在体内结合;也可用

于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。

染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecitation,ChIP)就是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它的基本原理就是在生理状态下把细胞内的蛋白质与DNA交联在一

起,超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过所要研究的目的蛋白质特异

性抗体沉淀此复合物,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断进行PCR检

测,可以知道目的蛋白与那些基因作用。

RNA免疫沉淀就是研究体内RNA与蛋白质相互作用的重要手段。它的基本原理就是在生理状态下针对可以结合RNA的蛋白质进行免疫沉淀,然后通过分离抗体-Protein A/G

beads复合物中的RNA成份,最后通过基因芯片或者其它手段检测目的RNA。

由此可见,CO-IP与CHIP以及RIP都就是基于IP的基本原理去实现不同的研究目的,CO-IP主要就是研究目的蛋白X与与之发生相互作用的蛋白Y之间的作用关系;而CHIP

主要就是研究目的蛋白X与与之发生相互作用的DNA片段Y之间的作用关系;RIP主要就是

研究RNA结合蛋白与RNA之间的结合。这也就决定了在进行IP,CO-IP与CHIP以及RIP

实验时时操作步骤与涉及的缓冲液配方都有所不同。

免疫沉淀,免疫共沉淀,染色质免疫沉淀与RNA免疫沉淀在实验操作中所要注意的关键点的主要区别就是什么？

免疫沉淀:因为免疫沉淀的目的主要就是通过抗体与目的蛋白相互作用从而捕获目的蛋白,所以实验中要注意的关键点就是抗体与目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗体的结合能

力,目的蛋白与抗体的可接触性两个因素影响。所以免疫沉淀实验中的关键因素就是抗体的选

择以及裂解缓冲液中的配方。对于前者而言,抗体所针对的作用表位必须处于目的蛋白表面,

对抗体结合力的要求与免疫印迹或者免疫荧光相比要高得多;对于后者而言,主要考虑因素就

是缓冲液中的去垢剂成分能否在不破坏目的蛋白天然构象的情况下(不影响目的蛋白与抗体

的相互作用效果)将目的蛋白从细胞局部定位(比如位于某些细胞器中)中有效释放出来。

免疫共沉淀:免疫共沉淀的目的就是通过抗体与目的蛋白的相互作用从而捕获目的蛋白复合物,最终检测目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用。所以实验中要注意的关键点与免

疫沉淀相比,除了要注意抗体与目的蛋白相互作用的效果外,还要注意目的蛋白复合物的完整

性。后者主要考虑因素就是缓冲液中的去垢剂成分能否在有效释放目的蛋白复合物进入可溶

相的情况下不破坏目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用。所以,免疫共沉淀实验中的关键

因素除了抗体的选择外,裂解缓冲液配方中的去垢剂的成分与浓度对免疫共沉淀实验的成功与

否至关重要,其选择相比免疫沉淀实验而言,要求更严格。

染色质免疫共沉淀:染色质免疫沉淀的主要目的通过抗体与目的蛋白的相互作用从而捕获与目的蛋白有相互作用的DNA片段,最终检测目的蛋白与DNA片段的相互作用。因此,实

验中要注意的关键点与前二者(免疫沉淀与免疫共沉淀)有所不同。因为在实验中中蛋白质-

DNA复合物的维持需要依靠多聚甲醛的交联作用,所以目的蛋白的许多表面表位也在交联过

程中丧失。因此,除了后续的基本操作与免疫沉淀以及免疫共沉淀有些许不同,有额外需要注

意的就是向外,其对抗体的要求要比免疫沉淀与免疫共沉淀高得多,相对而言,裂解缓冲液的成

份并不就是关键因素。

免疫共沉淀与GST-Pull down有什么区别？

免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行,这样蛋白质之间的天然相互作用得以最大程度

的保留,因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用。但也基于此点,免疫共沉淀并不能

显示蛋白质之间的相互作用就是直接还就是间接的,因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的就是

一个蛋白复合物,而不仅仅就是与目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pull down实验可

以通过体外实验条件,去除其它蛋白的影响,从而确定目的蛋白与待检测蛋白就是否可以发生

直接相互作用。

免疫沉淀,免疫共沉淀与RNA免疫沉淀以及染色质免疫沉淀一般都用于什么实验目的？

实验名称研究目的研究用途备注

免疫沉淀研究目的

蛋白的理

化特性

蛋白纯化利用抗体与抗原的特异性结合达到纯化抗原的目的

去除目的蛋白利用抗体与抗原的特异性结合达到从含有抗原的反应液中去除

优化免疫印迹

(WB)效果

通过IP可以对目的抗原进行富集(最高可以富集10,000倍),然

后进行WB。由于对目的抗原进行了富集,提高了抗原浓度,这

样可以解决许多抗体WB实验效果不好(包括特异性不好与背

景严重)的问题

测定蛋白修饰

位点信息

可以通过免疫沉淀纯化抗原去进行质谱鉴定从而测定蛋白的修

饰位点的信息(磷酸化,甲基化,乙酰化与糖链修饰等)

测定蛋白的降

解速度

通过免疫沉淀纯化经由放线菌酮处理的细胞样品中的抗原再通

过WB测定不同样品中目的抗原的含量;或者对细胞进行同位

素脉冲标记然后进行免疫沉淀实验再通过放射自显影测定目的

抗原的含量

测定酶活经免疫沉淀纯化待测酶后再进行酶活测定(包括激酶测定等)

免疫共沉淀研究蛋白

与蛋白的

相互作用

寻找新的相互

作用蛋白

经由免疫共沉淀然后通过质谱或者WB鉴定新的相互作用蛋白验证目的蛋白

与待测蛋白就

是否有相互作

用

经由免疫共沉淀然后通过使用待测蛋白的抗体进行WB实验可

以确定目的蛋白与待测蛋白就是否有相互作用

染色质免疫沉淀研究蛋白

与DNA

的相互作

用

研究蛋白与

DNA的动态

作用

通过对经由免疫共沉淀而得到的DNA片段进行PCR实验可以

获得DNA片段的序列信息以及目的蛋白与DNA之间的动态

作用信息

研究组蛋白的

各种共价修饰

与基因表达之

间的关系

通过使用针对组蛋白不同修饰位点的抗体进行染色质免疫沉淀

实验去检测组蛋白的不同修饰状态与目的基因启动子之间的动

态相互作用,从而研究组蛋白修饰与目的基因表达之间的关系研究蛋白与

RNA的相互

基于CHIP的原理发展出来的RIP(RNA-IP)技术可以用来研究

目的蛋白与RNA之间的相互作用信息

作用

我该选择什么样的抗体做免疫沉淀,免疫共沉淀与RNA免疫沉淀以及染色质免疫沉淀？

在所有免疫沉淀相关实验中,抗原的起始浓度相对其它免疫相关实验(WB与IF等)要低得多,所以对抗体的亲与力相对其它实验(WB与IF等)提出了很高的要求,这就需要使用高亲

与力的抗体去进行免疫沉淀相关实验。同时,由于免疫沉淀相关实验主要就是在生理条件性进

行,所以需要抗体识别蛋白的天然表面构象,因此选择的抗体其针对的抗原决定蔟需要暴露在

蛋白表面。这些因素对制备能成功应用于IP实验的抗体提出了很高的要求:

a.用于免疫的蛋白抗原其构象需要尽量接近目的蛋白的天然构象或者用于免疫的多肽尽量

暴露在目的蛋白的表面。获得接近天然构象的蛋白抗原的途径有很多,主要有天然提取,

原核表达重组蛋白以及真核表达重组蛋白三种方式。这其中,就蛋白构象角度而言,天然

提取就是最佳途径,但这种方法受材料来源限制与纯化方法复杂等多因素影响,一般很少

采用。原核表达因为成本低廉,操作方便最为受欢迎,但其受表达环境与大部分蛋白天然

存在环境差别巨大,构象失真情况严重,抗原的构象质量有严重问题。大规模瞬时真核表

达就是近期新兴的表达系统,具有表达环境接近天然,操作方便等诸多优点,就是获取具有

天然构象蛋白抗原的首选工具。

b.亲与力要比普通的抗体应用要求高得多。多克隆抗体由于可以结合目的抗原的多个抗原

决定簇,所以在亲与力方面就是首选。但考虑到特异性,获得单克隆抗体群就是更好的选

择。具体优缺点总结如下表。

多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体群(由一个免疫原产生的多个单克隆抗体混合物)

抗体抗原作用信号强度极佳

由抗体的亲与力决定(极佳

或者极弱)

极佳

特异性通常很好,但有时会有极佳,但有时会有交叉反应极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉

非特异性相互作用反应的抗体组成单克隆抗体群)

优点亲与力高(由于抗体可

以与目的蛋白的多个

抗原决定蔟相互作用)

特异性好,且可以无限量供

应

特异性好,亲与力高(由于选择可以进行

IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆

抗体群)

缺点非特异性相互作用很

难去除

需要筛选亲与力高的抗体;

抗原表位可能会被相互作

用蛋白遮蔽

能够筛选得到的符合条件的单克隆并不

多,所以单克隆抗体群也就不容易获得

免疫沉淀效果极佳(由于亲与力高) 由抗体的亲与力决定(极佳

或者极弱)

极佳(由于选择可以进行IP且没有交叉

反应的抗体组成单克隆抗体群)

免疫共沉淀效果通常很好,但有时非特

异性相互作用会带来

假阳性

由抗体的亲与力决定与抗

原表位就是否被相互作用

蛋白遮蔽决定(极佳或者极

弱)

极佳(由于选择可以成功进行IP且没有

交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)

染色质免疫沉淀效果通常很好,但有时非特

异性相互作用会带来

假阳性

由抗体的亲与力决定与抗

原表位就是否被遮蔽或者

以及抗原表位就是否被交

联实验所破坏决定(极佳或

者极弱)

极佳(由于选择可以成功进行IP且没有

交叉反应的抗体组成单克隆抗体群)

Troubleshooting for IP, CO-IP,RIP and CHIP

免疫沉淀

产生的问题产生问题的原因解决办法

没有得到目的蛋白或者得到的目的蛋白太少1、目的蛋白在样品中含量太低或者检

测样品中没有目的蛋白

更换样品或者在细胞中过表达目的基因

2、加入的proteinA/G-beads太少或

者与一抗的结合属性不匹配

增加proteinA/G-beads至60ul/mg总蛋白;检

查proteinA/G-beads与一抗的结合属性

3、抗体或者proteinA/G-beads与样

品作用时间太短

正确按照protocol操作,抗体或者proteinA/G-

beads与样品作用时间最短不能少于2小时

4、蛋白发生降解尽量使用新鲜制备样品进行免疫沉淀实验;将样

品至于冰上或者在冷库中操作

5、杂蛋白太多加入抗体与proteinA/G-beads前100,000g离

心细胞30 min以去除膜成分或者不可溶蛋白

6、目的蛋白没有溶解或者溶解不充分针对目的蛋白的特性选择合适的裂解液

7、抗体使用浓度太低提高抗体使用浓度

8、抗体亲与力差更换亲与力更高的抗体

9、抗体所识别的抗原表位被相互作用

蛋白所遮蔽,无法与目的蛋白相互作用

更换抗体

10、抗体选择不合适,所选择的抗体不

能识别处于天然构象的蛋白

更换抗体

11、抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间太短正确按照protocol操作,抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间最短不能少于2小时

12、洗涤条件过于剧烈减少洗涤次数;降低洗涤缓冲液中的盐浓度或者

更换更温与的去垢剂

13、检测灵敏度不够更换检测试剂(针对WB检测)或者提高检测水平

(针对质谱检测)

有非特异性相互作用或者严重的交叉反应1、Protein A/G-beads对蛋白的非特

异性吸附或者样品中有其它蛋白与

Protein A/G-beads有交叉反应

用ProteinA/G-beads对细胞进行预处理去除非

特异性吸附蛋白,然后再加入抗体;加入2%BSA

于ProteinA/G-beads中对beads进行预封闭2、抗体特异性不好更换抗体或者设立阴性对照(IgG或者其它无关

抗体)

3、裂解液配方过于温与使用条件更加剧烈的裂解液配方 (比如RIPA缓

冲液)

4、洗脱条件过于温与使用高盐(大于150nM NaCl)或者其它强表面活

性剂洗脱

目的蛋白大小与IgG的重链与轻使用不同种属的抗体分别进行IP与WB实验使用交联剂DSS将一抗与ProteinA/G-beads

链接近,影响检

测

共价偶联后进行免疫沉淀实验

免疫共沉淀

产生的问题产生问题的原因解决办法

没有检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或者检测得到的

信号太弱裂解液中的去垢剂浓度过

高或者配方过于剧烈

降低去垢剂浓度或者更换去垢剂种类(按作用剧烈

程度来区分:

SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS)

受蛋白的亚细胞定位影响重新选择裂解液配方以释放目的蛋白

蛋白与蛋白之间的相互作

用太弱或者不太稳定

选择亲与力更高的抗体以捕获更多的目的蛋白从

而捕获更多的相互作用蛋白;过表达提高目的蛋白

的含量;选择目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的

样品进行免疫共沉淀实验

假阳性太大,有太多非特异性相互作用蛋白被检测到抗体浓度过高降低抗体作用浓度抗体特异性不好更换抗体

染色质免疫沉淀

产生的问题产生问题的原因解决办法备注

没有检测到与目的蛋白相互作用的DMA片段或者检测到的信号太弱染色体片段太小

超声(X-CHIP)或者酶解(N-CHIP)

片段不要小于500bp

过度交联

严格按照protocol进行操作,多

聚甲醛交联时间控制在10-15

min

多度交联会导致更多的抗原表

位被破坏,影响抗体与目的蛋

白的结合

实验的染色体量不够不要少于25ug

使用N-CHIP方法去进行当目的蛋白与DNA片段之间的组蛋白与DNA片段之间的作

实验相互作用比较弱时改用X-CHIP

方法用比较强,可以使用N-CHIP 方法

使用了不合适的单抗使用多抗或者单克隆抗体群或者

更换合适的单抗

多聚甲醛交联会破坏许多抗原

表位使得某些单抗的作用效果

会减弱

目的蛋白没有与待测DNA片段结合使用阳性对照判断CHIP实验就是否成功

PCR实验失败(引物设计不合理或者PCR反应条件不佳) 重新设计引物或者摸索最佳PCR 条件

假阳性太大,有太多非特异性结合DNA片段被检测到抗体浓度过高降低抗体作用浓度抗体特异性不好更换抗体

PCR污染重新配置PCR缓冲液