细胞工程原理

1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。
1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和 Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主要 成分是Ti质粒。 1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。
1979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方 法进行转化。 1981年，Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonal variation）”这一术语。 1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明 可以用外源DNA对原生质体进行遗传转化。 1982年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。 1985年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生 的转化植株。
– 通常在胚胎发育早期，在某一胚域内具有分化成几种 器官和组织的能力(多分化能力)，但随着发育的进行， 分化能力就会受到限定。
植物组织培养技术
一、植物组织培养的概念
1. 概 念 植物组织培养（Plant tissue culture） 广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上 对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体 甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征 （1）在培养容器中进行； （2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以 及害虫等的侵入； （3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、 温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；
（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植 物显微结构进行操作成为可能。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培 养。 （5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。 （6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的 原生质体进行培养。
矮牵牛茎尖离体培养培养
牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖
四、植物组织培养技术的发展历史
• • • 1、 早期探索阶段 （1930年以前）
1893年，Schwann和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。
• 1902年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养 技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养， 但未能培养成活。 • 1904年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。 • 1922年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年， Knotte和Robbins对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花 的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。 • 1925年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并 于1929年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为
不同类型。
1、根据培养材料不同分为：
（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等 的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、 花器官的培养。
种质资源的离体保存
体细胞无性系变异筛选
花粉、花药培养产生单倍体植株
幼胚拯救克服远缘杂交障碍
用于基因工程技术创造植物新种质。
3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次 生代谢物质；
根培养:正常根培养， 毛状根培养
4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、 病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。
直接器官发生
间接器官发生
体细胞胚胎发生
贯叶金丝桃不定芽直接再生过程
非洲紫罗兰叶片培养
优化培养基
无蔗糖
1%蔗糖
5%蔗糖
无BAP
BAP 0.1mg/l
BAP 5.0mg/l
无NAA
台湾百合离体培养
器官发生途径（原球茎的形成）：
大花蕙兰原球茎增殖与植株再生
大蒜愈伤组织培养
日本牵牛花的离体培养
（1）固体培养（Solid culture）: 琼脂、卡拉胶等 固化。 （2）半液半固体培养(Semisolid Culture)：固液双 层。 （3）液体培养(Liquid Culture)：震荡、旋转或静置 培养。
液体培养的优点： A 不使用凝固剂，节约生产成本 B 营养吸收充分； C 操作过程简化。
细胞工程原理
2012.9
细胞工程的定义
细胞工程 (cell engineering)是以细胞生物学和 分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或 组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究
改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞
系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有
关理论和技术方法的学科。
甘蔗、马铃薯、大蒜等。
virusfree tissue
茎尖培养脱毒
脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养
2、用于植物遗传育种 包括种质资源离体保存；花粉花药培养产 生单倍体；胚乳培养产生三倍体；胚培养拯救 杂种胚克服远缘杂交障碍；原生质体培养进行 体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛 选；用于植物基因转移操作等。
固体培养：
液体培养
体胚液体培养
不同类型液体培养装置
液体培养体系
菠萝种苗液体培养系统
丹参毛状根培养
三、植物组织培养技术的理论基础
植物细胞的全能性(Plant cellular totipotency） 从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该 植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件 下，具有发育成完整植株的潜在能力。
1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同 年，首次应用微型嫁接技术。
1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。 1955年，Miller等发现了一种促进细胞分裂的植物激素—激动素，后来 发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万 倍。 1957年，Skoog和Miller发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根 和芽的发生。 1958年，Maheshwari和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生 获得体细胞胚；同年，Reinert 和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细 胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发 生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。
• 一、几个基本的名词术语 • 分生（generating）：是将盆栽1年以上、内生长过 于拥挤的植物带根分割成几部分，或将植物分生出 来的幼植物体。 • 分化（differentiation）：在某一正在发育的个体细 胞中进行形态的、功能的特殊变化并建立起其他细 胞所没有的特征，这样建立特异性的过程称之为分 化。
植物胚胎发生理论研究
生长发育特性研究
Mature embryo culture and rapid propagation of tree peony
微型月季茎段离体培养
花烛叶片离体快速繁殖
大蒜根尖培养及植株 再生
大蒜试管鳞茎 诱导
人参细胞悬浮 培养
非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生
2、根据再生途径分为：
（1）器官发生途径（Organogenesis）： 直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。 如茎尖培养。 间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化 （dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形 成新的组织和器官的过程。如叶片培养。 （2）体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）： 体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件 下．未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出 新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构 称为胚状体（embryoid）或体细胞胚(somatic embryo).
五、植物组织培养技术的应用
1、优质种苗的快速无性繁殖： （1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖
园艺植物种苗工厂化生产
兰
F
G
花烛属植物
厥类植物
盆栽及切花植物的繁殖
珍贵树种
无菌苗快速繁殖
无菌苗驯化
组培苗驯化移栽
茎、芽和小植株的规模培养
经济植物快速繁殖
（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、
3、植物组织培养技术的发展（1960年以后）
1960年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖； 1962年，Murashige和Skoog开发出最著名的Murashige和Skoog培养基 （MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。 1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例 单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。 1971年，Takebe等获得第一例原生质体培养的再生植株。
禾本科牧草的体胚发生过程
菊花体细胞胚胎发生及植株再生
大蒜体细胞胚胎发生过程
人工种子（Artificial seed，Synthetic Seed）：是指植物离体培养产生的胚状体或不 定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳 和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。 作为繁殖材料。
3、根据培养基的类型分为:
2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）
1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取 液可促进离体胚的生长。 1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植 物生长发育的控制起重要作用。 1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层 诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细 胞培养也得到了类似的结果。 1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生 由生长素/腺嘌呤的比例决定。 1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。
细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖 目的：获得新性状、新个体、新物质
细
植物细胞工程
胞
工
程
动物细胞工程
植物组织培养
植物体细胞杂交
植物细胞工程的发展
原因：具备该物种的全套遗传物质
细胞分裂能力越强，全能性越高。 植物>动物 受精卵>生殖细胞>体细胞(幼嫩>老细胞)
第三节 脱分化与再分化