转基因技术与作物育种
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14
（二）目的基因重组质粒的构建
目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中 包括保存用中间载体（大肠杆菌寄主）：pBR322、pUC、
pBluescript K、pKS,pGEM-T 繁殖载体（大肠杆菌寄主）： JM109, TOP10 植物转化载体（农杆菌寄主）： pBI121, pCAM1001
15
3
•Traditional crossbreeding
Recombinant DNA techniques
4
二、 转基因育种的程序
基因分离 载体的构建
体外重组
农杆菌介导 基因枪轰击
转化
转化体 筛选
结合常规育种 转基因品种
遗传稳定性 评价
安全性评价
市场开发
5
(一)目的基因的获得 根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。
氨基酸序列比较 设计简并引物 PCR扩增
文库筛选/RACE
7
(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包 含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过 cDNA的途径获得。
获得EST的途径: 大规模cDNA文库测序 各种mRNA水平的分析手段
cDNA文库
反转录酶
• 包含Ti质粒
• T-DNA (TransferredDNA), 可以转移进入植 物基因组.
Tumor induced by A. tumefaciens
17
Ti Plasmid
T-DNA region
auxin
Left border
vir genes
Right border
已知农杆菌附着到 植物细胞后，只留 在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被 加工、剪切、复制， 然后转入植物细胞。
互补实验
10
(4)转座子标签法 转座子是染色体上一段可复制、移动的 DNA片段。 当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导 产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又 可得到恢复。 目前应用最为广泛的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。
转座子DNA探针
插入突变体
ori
18
源自文库
Ti质粒的遗传特性及类型
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合 的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D, 约有200kb组成。
根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分 成四种类型： 章鱼碱型(octopine) 胭脂碱型(nopaline) 农杆碱型（agropine） 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)
转基因技术与作物育 种
1
什么是转基因育种? 作物转基因育种 就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重 组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定 表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因 新品种或种质资源。
转基因作物（GMC，genetically modified crops）
鉴定性状 遗传分析
筛选突变DNA 文库，PCR，
RACE
基因部分DNA探针
完整目的基因
筛选野生型DNA 文库，PCR， RACE
互补实验
11
(5)差异显示法 在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞 中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式， 叫做基因的差异表达。差异显示PCR(differential displayPCR,DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、 电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。
2
与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很 高，但是具有常规育种所不具备的优势： 1.拓宽可利用的基因资源； 2.培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径； 3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择； 4. 可以大大提高选择效率，加快育种进程。 此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。
1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆 主要步骤如下：
分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列
人工合成
利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。 局限性：兼并密码子
效率低 未知基因及产物
6
2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因
(1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特 点克隆基因家族未知成员。
mRNA
cDNA
PCR 差异显示
EST
GenBank
抑制消减杂交 …
dbEST
RACE/文 库筛选
8
(3)根据连锁图谱克隆目的基因 图位克隆技术(Map-based cloning)
9
cM Marker
bp BAC
染色体步移 亚克隆 染色体步移
候选基因
1 a
0.8 Gene c
精细定位
cDNA文库筛选
分离基因
克隆到某中间载体 pKS,pBR332,pGEM-T
转化大肠杆菌 JM109, TOP10… 提取质粒
限制酶切/连接 HindIII/EcroI… T4 ligase 克隆到植物表达载体 pBI121, pCAM1001…
转化农杆菌
基因枪转化
LBA4404, EHA
16
• 农杆菌:多用于植物基因 工程.
mRNA 1 mRNA 2
13
(6) 电子克隆 in silico cloning
利用计算机技术, 依托现有的网络资源 ( EST数据库、核苷酸数据库、 蛋白质数据库、基因组数据库等) ，采用同源性序列比对和归类分析、 重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列 可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根 据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆 出相应基因的方法类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。
随机引物+3’ 锚定poly(t)引物
叶mRNA
反转录
PCR
根mRNA
反转录
PCR
PAGE
叶根
12
(6) cDNA微阵列, cDNA 芯片 cDNA序列（纯样）机器点样在支持物,与荧光标记的不同mRNA样品分 别进行杂交,通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度, 判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度.
（二）目的基因重组质粒的构建
目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中 包括保存用中间载体（大肠杆菌寄主）：pBR322、pUC、
pBluescript K、pKS,pGEM-T 繁殖载体（大肠杆菌寄主）： JM109, TOP10 植物转化载体（农杆菌寄主）： pBI121, pCAM1001
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•Traditional crossbreeding
Recombinant DNA techniques
4
二、 转基因育种的程序
基因分离 载体的构建
体外重组
农杆菌介导 基因枪轰击
转化
转化体 筛选
结合常规育种 转基因品种
遗传稳定性 评价
安全性评价
市场开发
5
(一)目的基因的获得 根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。
氨基酸序列比较 设计简并引物 PCR扩增
文库筛选/RACE
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(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包 含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过 cDNA的途径获得。
获得EST的途径: 大规模cDNA文库测序 各种mRNA水平的分析手段
cDNA文库
反转录酶
• 包含Ti质粒
• T-DNA (TransferredDNA), 可以转移进入植 物基因组.
Tumor induced by A. tumefaciens
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Ti Plasmid
T-DNA region
auxin
Left border
vir genes
Right border
已知农杆菌附着到 植物细胞后，只留 在细胞间隙中。TDNA首先在细菌中被 加工、剪切、复制， 然后转入植物细胞。
互补实验
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(4)转座子标签法 转座子是染色体上一段可复制、移动的 DNA片段。 当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导 产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又 可得到恢复。 目前应用最为广泛的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。
转座子DNA探针
插入突变体
ori
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源自文库
Ti质粒的遗传特性及类型
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合 的环状DNA分子，其分子量为95～156×106D, 约有200kb组成。
根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分 成四种类型： 章鱼碱型(octopine) 胭脂碱型(nopaline) 农杆碱型（agropine） 农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)
转基因技术与作物育 种
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什么是转基因育种? 作物转基因育种 就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重 组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定 表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因 新品种或种质资源。
转基因作物（GMC，genetically modified crops）
鉴定性状 遗传分析
筛选突变DNA 文库，PCR，
RACE
基因部分DNA探针
完整目的基因
筛选野生型DNA 文库，PCR， RACE
互补实验
11
(5)差异显示法 在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞 中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式， 叫做基因的差异表达。差异显示PCR(differential displayPCR,DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、 电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。
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与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很 高，但是具有常规育种所不具备的优势： 1.拓宽可利用的基因资源； 2.培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径； 3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择； 4. 可以大大提高选择效率，加快育种进程。 此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。
1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆 主要步骤如下：
分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列
人工合成
利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。 局限性：兼并密码子
效率低 未知基因及产物
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2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因
(1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特 点克隆基因家族未知成员。
mRNA
cDNA
PCR 差异显示
EST
GenBank
抑制消减杂交 …
dbEST
RACE/文 库筛选
8
(3)根据连锁图谱克隆目的基因 图位克隆技术(Map-based cloning)
9
cM Marker
bp BAC
染色体步移 亚克隆 染色体步移
候选基因
1 a
0.8 Gene c
精细定位
cDNA文库筛选
分离基因
克隆到某中间载体 pKS,pBR332,pGEM-T
转化大肠杆菌 JM109, TOP10… 提取质粒
限制酶切/连接 HindIII/EcroI… T4 ligase 克隆到植物表达载体 pBI121, pCAM1001…
转化农杆菌
基因枪转化
LBA4404, EHA
16
• 农杆菌:多用于植物基因 工程.
mRNA 1 mRNA 2
13
(6) 电子克隆 in silico cloning
利用计算机技术, 依托现有的网络资源 ( EST数据库、核苷酸数据库、 蛋白质数据库、基因组数据库等) ，采用同源性序列比对和归类分析、 重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列 可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根 据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆 出相应基因的方法类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。
随机引物+3’ 锚定poly(t)引物
叶mRNA
反转录
PCR
根mRNA
反转录
PCR
PAGE
叶根
12
(6) cDNA微阵列, cDNA 芯片 cDNA序列（纯样）机器点样在支持物,与荧光标记的不同mRNA样品分 别进行杂交,通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度, 判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度.