小鼠衰老检测

小鼠全体实验记录
1，全身拍照
衰老治疗正常组
正常组衰老治疗组
2，全身称重
寿命
1.对平均寿命（mean lifespan）/最大寿命（maximum lifespan）的影响
二、衰老性心脏肥大
1.心室中部横截面染色，观察截面大小情况，年轻小鼠较小，老年小鼠肥大。

2.心脏重量/胫骨长度（mg/mm），表征肥大状况，数值越大，衰老程度越高。

（选择原因：胫骨长度在小鼠发育成熟后不再有变化，可作为量化对比标准）
3.左心室（left ventricle，LVs）PAS染色（过碘酸雪夫染色，periodic acid Schiff stain），观察细胞横截面积大小。

（心脏肥大是因为细胞个体变大还是细胞数量变多）
4.心肌细胞（cardiomyocyte，CM）横截面积（crosssectional area，CSA）测定。

雌雄分组，每个动物选5个独立切片，结果根据平均值计算，测量方法：选取一定面积区域，数区域内细胞数量，计算出心肌细胞横截面积。

5.小鼠心脏部位取材，RT-PCR测量心房利尿钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）,脑钠素（brain natriuretic peptide，BNP）,肌浆网钙ATP酶（sarcoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA-2）的表达量。

6.Western测生长分化因子11 （growth differentiation factor 11，GDF11）在血浆的水平。

老年小鼠少，年轻小鼠多。

三、认知功能
1.Morris水迷宫实验（Morris water maze，MWM）。

学习逆转阶段评估短期学习记忆能力、探索阶段评估长期记忆、对象偏好评估识别记忆、对新伙伴的认可能力。

2.海马裂解物中，免疫印迹定量突触蛋白I（synapsin I）、突触素（synaptophysin）、突触后密度蛋白（postsynaptic density protein 95，PSD95）。

3.测定整个海马的基因表达谱，2090个可变表达基因分层聚类。

156个最上调和76个最下调的转录物进行基因本体富集分析的网络可视化。

4. RT-PCR评估Klotho（KI）甲状腺素转运蛋白（transthyretin ，Ttr）、Bdnf
5.来自海马裂解物的免疫印迹定量分析，包括CREB/ERK/Akt的磷酸化和总cAMP，组蛋白H3, H4 ，H2A。

四．生殖能力
1.足月妊娠成功的比例/数量（雌性小鼠）
2.后代存活数量
3.卵巢部位切片，对EGFP表达免疫分析。

五．骨质疏松
1.小鼠BMSCs中衰老标记物53BP1和c-H2AX的表达。

表达量大表示干细胞衰老。

2.左图是小鼠胫骨三维（3D）图像，中间图像是X射线图像，右图像小鼠胫骨样本的3Dmicro-CT 重建图像，计算骨体积分数BV/TV
六．其他
1.衰老抑制剂加入后21天，测定SA-β-半乳糖苷酶活性，活性降低，表示抗衰老效果好
2.加入后21天，测定细胞增殖量（与对照组比较），细胞增殖量多，抗衰老效果好
3.降低ATM磷酸化水平，以及其下游目标p-CHK2, p-p53, 和p21。

衰老相关的p16marker也
在治疗后下降
4.流式细胞仪测定线粒体膜电位（与年轻小鼠对照）
5.氧消耗量（OCR）（与年轻小鼠对照）
6.细胞外酸化速率（ECAR）（与年轻小鼠对照）
7.糖酵解/氧化磷酸化ATP的生成量（与年轻小鼠对照）
8.对活性氧ROS监测，其中DHR123对羟基自由基、过氧化氢染色，MitoSOX对超氧阴离子染色
9.细胞核形态观察（与年轻小鼠对照）
10.肝、脑组织中单胺氧化酶MAO-B活性，活性越低越年轻。

11.全血谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性和心肌脂褐素含量，GSH-Px活性高年轻，心肌脂褐素含量低年轻。

12.皮肤中羟脯氨酸Hyp的含量，含量越高越年轻。

13.各组织、脏器（皮肤，心肝脾肺肾脑等）中脂质过氧化物MDA（丙二醛）的含量，含量低年轻，超氧化物歧化酶SOD活性，活性越高越年轻。

参考文献：
Loffredo F S, Steinhauser M L, Jay S M, et al. Growth Differentiation Factor 11 is a Circulating Factor that Reverses Age-Related Cardiac Hypertrophy[J]. Cell, 2013, 153(4):828-39. Bilkeigorzo A, Albayram O, Draffehn A, et al. A chro nic low dose of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) restores cognitive function in old mice.[J]. Nature Medicine, 2017.
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