皮肤角质形成细胞的原代培养

角质形成细胞原代培养的准备工作

补充培养基的配制：

（1）将0.5ml浓度为0.06M的CaCl2加入到500ml基础培养基中，则培养基中CaCl2浓度为0.06mM；

（2）将5mlHKGS（人的角质形成细胞生长添加剂）加入到基础培养基中。

（3）向其中加入50ul 双抗（100x），使培养基中双抗比例为1%。胶原涂层培养瓶：

（1）在超净台无菌操作下，向培养面积为25cm2的细胞培养瓶中先加入1.7ml稀释液，再向其中加入17ul胶原（培养面积为75cm2的培养瓶先加5ml稀释液，再加50ul胶原）；

（2）来回剧烈摇晃使胶原蛋白均匀分布于培养瓶表面，拧紧瓶盖在室温下孵育30min；

（3）从培养瓶中吸取出多余的胶原或稀释液；涂层后的培养瓶可立即使用，或者短时间内放置于2°C-8°C备用。

消化液：0.025%胰酶+0.01%EDTA

可用(0.25%胰酶+0.1%EDTA)稀释十倍得到

其中的百分比表示质量体积比，即0.25%胰酶表示0.25g胰酶

溶于100mlPBS溶液；0.1%EDTA表示0.1gEDTA溶于100mlPBS

溶液。

终止消化液：含10%血清的DMEM或含10%血清的PBS溶液

冻存比例：80%含细胞的培养基+10%血清+ 10%含DMSO的冻存液

皮肤角质形成细胞的原代培养

复苏

（1）将装有皮肤角质形成细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37°C温水中来回摇动（将冻存管下半部分浸入温水中），使其

在2min内完全融化。

（2）用1ml移液枪将冻存管内已融化液体全部转移至15ml离心管中，再向冻存管中加入1ml已配置好的补充培养基，用移液枪

反复冲洗后也转移至离心管内。

（3）进行1500r，5min离心;弃上清，加入补充培养基后，再次离心，反复两次；离心后可观察到离心管底部的细胞团。

（4）向离心管中加入1ml补充培养基，用移液枪反复吹打使细胞重悬，分散均匀；从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝

稀释，用细胞计数器测定1ml培养基中的活细胞数；用配置好

的补充培养基稀释离心管中细胞数为1.25×104/ml，向培养面

积为25 cm2的已被胶原涂层细胞培养瓶里加入5ml细胞悬液。（5）轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2的细胞培养箱里培养，24h勿动，待细胞贴壁后可换液。

换液

刚复苏的细胞可在24h-36h后换液；随之在48h后换液；之后每隔一天换一次液，直至细胞覆盖培养瓶表面50%；一旦细胞覆盖培养瓶表面达到50%，则保持每天换液直至细胞覆盖培养瓶表面达到

传代

（1）当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基。（2）向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），用1ml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再向培养瓶中加入1ml

消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），摇匀使培养瓶表面被覆盖。

室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概

4-5min，轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来。

（3）向培养瓶中加入1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中。

（4）再向培养瓶中加1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml

离心管中。

（5）进行1500r，5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清。

（6）加入1ml培养基后重悬细胞，用1ml的移液器反复吹打使细胞浓度均匀。

（7）从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数仪测定1ml培养基中的细胞数；计算好之后用补充培养基稀释

细胞悬液，以细胞数为1.25×104/ml个进行传代。

（8）轻轻摇动细胞培养瓶使细胞均匀分散开；放置于37°C,5%CO2的细胞培养箱里进行培养。

（1）当细胞覆盖培养瓶表面达80%时，弃除培养瓶中的培养基。（2）向培养瓶中加入1ml消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），用1ml移液枪吹打洗一遍之后吸出弃除，再向培养瓶中加入1ml

消化液（0.025%胰酶+0.01%EDTA），摇匀使培养瓶表面被覆盖。

室温下孵育并在显微镜下观察，直至观察到细胞变圆，大概

4-5min，轻轻摇晃培养瓶把贴壁的细胞全部消化下来。

（3）向培养瓶中加入1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），然后把被消化下来的细胞转移到15ml离心管中。

（4）再向培养瓶中加1ml胰酶抑制剂（含10%血清的DMEM或PBS），用移液器进行冲洗，将含有细胞的溶液也转移至15ml

离心管中。

（5）进行1500r，5min离心，可观察到离心管底部的细胞团，弃上清后用PBS洗两遍，离心，弃除上清。

（6）加入1ml培养基后重悬细胞，用1ml的移液器反复吹打使细胞浓度均匀。

（7）从离心管中吸取20ul细胞悬液用20ul台盼蓝稀释，用细胞计数仪测定，并计算出离心管中的全部细胞数；

（8）重悬后弃除适量细胞悬液，使离心管中留有800ul细胞悬液；

再向其中加入100ul血清和100ul含10%DMSO的冻存液后重

悬并全部用1ml移液枪转移到冻存管中，做好标记。

（9）将冻存管先悬于液氮表面过夜后放置于液氮中进行保存。