口腔鳞癌细胞系中Podoplanin通过EGF-Src-Cas通路促进细胞迁移

口腔鳞癌细胞系中Podoplanin通过

EGF-Src-Cas通路促进细胞迁移

摘要

人类podoplanin是一种类似于唾粘蛋白的1型跨膜糖蛋白，它与细胞迁移、肿瘤细胞侵袭和转移有关。我们最近的口腔鳞癌（OSCC）研究证实podoplanin 免疫组化表达的程度与上皮发育不良相关并且与不良的病理分化级别有密切关系。此外，据报道Src与表皮生长因子受体（EGFR）有直接联系，在OSCC 细胞中被表皮生长因子（EGF）激活然后磷酸化Crk相关底物(Cas)，podoplanin 作用于Src和Cas的下游来促进细胞迁移。然而，podoplanin的分子功能尚不明确。在本次研究中我们在OSCC细胞系中通过实时RT-PCR，Western blotting 和scratch assay来阐明与podoplanin表达相关的各种生长因子包括EGF和Src-Cas信号通路的分子生物学功能。podoplanin被发现对癌细胞迁移和口腔中间质非金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达有显著的影响在被EGF激活后。podoplanin促进口腔癌细胞迁移，EGF-Src-Cas通路是一种口腔癌进程中的可能机制。

关键词:OSCC;podoplanin;EGF;MMPs;EGF-Src-Cas通路

介绍

人类podoplanin是一种类似于唾粘蛋白的1型跨膜糖蛋白，由162个氨基酸组成。这种蛋白最初在大鼠足细胞的表面被检测出来，是一种38kDa的粘蛋白，这些大鼠被嘌呤霉素诱导肾病，这种蛋白与扁平足有关。podoplanin在细

胞收缩和细胞骨架再造中具有一定作用。

几个研究表明podoplanin的过表达与OSCC不良预后有关。我们以前的研究也表明podoplanin强烈的免疫组化表达与上皮发育不良和不良的病理分化级别有关。这些发现表明podoplanin与肿瘤发展（发育不良-癌）有关。

上皮间质转化（EMT）一种发展调节程序，具有显著的涉及转移上皮细胞向远处传播的能力和获得侵袭力及抵抗细胞凋亡的能力。两个以前的关于EMT 和podoplanin表达的联系研究已有对比发现。一个研究指出：podoplanin在肿瘤侵袭中具有作用，通过结合蛋白例如：埃兹蛋白，根蛋白和膜突蛋白来激活RhoA一种细胞因子，借此重建肿瘤细胞肌动蛋白细胞骨架并促成他们能动性的增强。另一研究指出：podoplanin转换了侵袭模式，从涉及EMT的单细胞转换成缺少EMT的大细胞群。在我们以前的研究中发现：62%podoplanin阳性的具有病理转移的原发OSCC中都存在EMT，而其余无EMT。这些发现表明肿瘤细胞中podoplanin表达不干扰EMT的发生。

Src属于无感受器的酪氨酸激酶家族，叫做Src族激酶（SFKs）。SFKs在许多细胞信号传导通路中有决定性的作用，它调节不同的进程包括细胞分裂，能动性，粘附血管发生和存活。SFKs在许多细胞类型中有诱导恶性转变的能力，并在不同种类的上皮和非上皮恶性存在频繁的过表达，它活性程度的增加常与恶性潜力有关。Src充当信号传导蛋白的角色，从细胞表面受体到在底物上酪氨酸残基连续的磷酸化。通过结合活化剂分子诸如：受体激酶接合器包括EGF,血小板来源的生长因子（PDGF），基本纤维生长因子（bFGF）和肝细胞生长因子（HGF）,或是有活性的受体本身，或是酪氨酸C端被某一酪氨酸磷酸酯酶去磷酸化，来转化SFKs为一种机能上有活力的形式，最后磷酸化下游的效应器并导

致细胞应答。

p130Cas是一种130kDa的支架蛋白，它是被补充为粘着斑后结扎成的整联蛋白。它的命名是因为联合并被Crk相关底物磷酸化。p130Cas包含一个SH3域，它通过干扰粘着斑激酶（FAK）来调节粘着斑的局限化。p130Cas中脯氨酸丰富结点区域位于底物结合域和C端之间，间接干扰SFKs。另外，在CHO 细胞中，p130Cas作用于FAK的下游来促进细胞迁移，在人胰腺癌细胞中作用于p130Cas和Crk之间来激活Rac，它是细胞迁移所必须的。因此，FAK/p130Cas相互作用被考虑为细胞迁移的“分子开关”。关于联合Src-Cas信号通路和podoplanin表达，Yongquan等人提出：podoplanin作用于Src和Cas 的下游，并且Src利用Cas来诱导podoplanin表达，从而促进肿瘤细胞迁移并导致癌侵袭和转移。

目前研究的目标是阐明podoplanin在肿瘤细胞迁移和侵袭中的分子生物学作用，通过在OSCC细胞系中刺激癌微环境生长因子如：bFGF，转化生长因子-β1（TGF-β1），HGF，PDGF和EGF，并检测Src-Cas信号通路。

材料和方法

细胞系和细胞培养

人类口腔鳞癌细胞衍生细胞系：Ca9-22，HSC-2，HSC-3和HSC-4。每一细胞系在RPMI1640培养基中常规生长，添加100 U/mL青霉素-链霉素，10 U/mL两性霉素B和10%胎儿牛组血清，在潮湿环境中5% CO2，37°C。

实时定量RT-PCR

所有的RNAs利用哺乳类动物细胞蛋白和RNA提取器提取，在提取前在每一细胞系中加100ng/mLbFGF,TGF-b1,HGF,PDGF,和EGF过24小时和48小

时。实时RT-PCR通过热循环实时系统完成。one-step SYBR primeScript RT-PCR Kit II用于反应。引物，源于podoplanin，MMP-2，MMP-2，MMP-2和甘油醛3脱氢酶（GAPDH）的序列，作为内部统一化控制，见表1。每一PCR 混合物（最终反应容积20 μL）包含10.0μL One Step SYBR RT-PCR缓冲剂4，0.8μL PrimeScript 1step Enzyme Mix 2,0.8μL正向引物，0.8μL反向引物，7.6μLRNA和无菌水。PCR条件：42°C / 5 min; 95°C / 10 s; 45 cycles of 95°C / 5 s,60°C / 30 s。按照解链程序完成分离。每个样本的RQ值根据双份测定并于GAPDH的平均值比较。

siRNA转染

siRNAs for podoplanin，c-Src siRNA和p130Cas与FuGENE转染剂以1:1稀释，并混合于RPMI1640培养基中。

苯丙醇2（PP2），一种Src的抑制剂这种化合物的原液来与二甲亚酚（DMSO）,储存与-80°C。

蛋白质印迹法（Western blotting）

细胞蛋白用PAREx提取，在提取前在每一细胞系中加100ng/mLbFGF,TGF-b1,HGF,PDGF,和EGF过24小时和48小时。抑制配位测定，在podoplanin siRNA，c-src siRNA和p130Cas siRNA混合物中加入PP2-DMSO溶液，之前加入100 ng/mL EGF过24小时和48小时。细胞溶解物被离心（at 12,000 rpm for 5 min at 4°C），上浮物被恢复用于蛋白质含量的测定。等分的蛋白置于10%十二烷硫酸钠聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）,然后转移至聚偏氟乙烯膜，用1%牛血清白蛋白（BSA）固定。膜中的特异蛋白被检测到，通过特异主要抗体一夜4ºC的潜伏期，之前加入特异二抗如抗鼠或抗兔结