口腔鳞癌细胞系中Podoplanin通过EGF-Src-Cas通路促进细胞迁移

口腔鳞癌细胞系中Podoplanin通过
EGF-Src-Cas通路促进细胞迁移
摘要
人类podoplanin是一种类似于唾粘蛋白的1型跨膜糖蛋白，它与细胞迁移、肿瘤细胞侵袭和转移有关。

我们最近的口腔鳞癌（OSCC）研究证实podoplanin 免疫组化表达的程度与上皮发育不良相关并且与不良的病理分化级别有密切关系。

此外，据报道Src与表皮生长因子受体（EGFR）有直接联系，在OSCC 细胞中被表皮生长因子（EGF）激活然后磷酸化Crk相关底物(Cas)，podoplanin 作用于Src和Cas的下游来促进细胞迁移。

然而，podoplanin的分子功能尚不明确。

在本次研究中我们在OSCC细胞系中通过实时RT-PCR，Western blotting 和scratch assay来阐明与podoplanin表达相关的各种生长因子包括EGF和Src-Cas信号通路的分子生物学功能。

podoplanin被发现对癌细胞迁移和口腔中间质非金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达有显著的影响在被EGF激活后。

podoplanin促进口腔癌细胞迁移，EGF-Src-Cas通路是一种口腔癌进程中的可能机制。

关键词:OSCC;podoplanin;EGF;MMPs;EGF-Src-Cas通路
介绍
人类podoplanin是一种类似于唾粘蛋白的1型跨膜糖蛋白，由162个氨基酸组成。

这种蛋白最初在大鼠足细胞的表面被检测出来，是一种38kDa的粘蛋白，这些大鼠被嘌呤霉素诱导肾病，这种蛋白与扁平足有关。

podoplanin在细
胞收缩和细胞骨架再造中具有一定作用。

几个研究表明podoplanin的过表达与OSCC不良预后有关。

我们以前的研究也表明podoplanin强烈的免疫组化表达与上皮发育不良和不良的病理分化级别有关。

这些发现表明podoplanin与肿瘤发展（发育不良-癌）有关。

上皮间质转化（EMT）一种发展调节程序，具有显著的涉及转移上皮细胞向远处传播的能力和获得侵袭力及抵抗细胞凋亡的能力。

两个以前的关于EMT 和podoplanin表达的联系研究已有对比发现。

一个研究指出：podoplanin在肿瘤侵袭中具有作用，通过结合蛋白例如：埃兹蛋白，根蛋白和膜突蛋白来激活RhoA一种细胞因子，借此重建肿瘤细胞肌动蛋白细胞骨架并促成他们能动性的增强。

另一研究指出：podoplanin转换了侵袭模式，从涉及EMT的单细胞转换成缺少EMT的大细胞群。

在我们以前的研究中发现：62%podoplanin阳性的具有病理转移的原发OSCC中都存在EMT，而其余无EMT。

这些发现表明肿瘤细胞中podoplanin表达不干扰EMT的发生。

Src属于无感受器的酪氨酸激酶家族，叫做Src族激酶（SFKs）。

SFKs在许多细胞信号传导通路中有决定性的作用，它调节不同的进程包括细胞分裂，能动性，粘附血管发生和存活。

SFKs在许多细胞类型中有诱导恶性转变的能力，并在不同种类的上皮和非上皮恶性存在频繁的过表达，它活性程度的增加常与恶性潜力有关。

Src充当信号传导蛋白的角色，从细胞表面受体到在底物上酪氨酸残基连续的磷酸化。

通过结合活化剂分子诸如：受体激酶接合器包括EGF,血小板来源的生长因子（PDGF），基本纤维生长因子（bFGF）和肝细胞生长因子（HGF）,或是有活性的受体本身，或是酪氨酸C端被某一酪氨酸磷酸酯酶去磷酸化，来转化SFKs为一种机能上有活力的形式，最后磷酸化下游的效应器并导
致细胞应答。

p130Cas是一种130kDa的支架蛋白，它是被补充为粘着斑后结扎成的整联蛋白。

它的命名是因为联合并被Crk相关底物磷酸化。

p130Cas包含一个SH3域，它通过干扰粘着斑激酶（FAK）来调节粘着斑的局限化。

p130Cas中脯氨酸丰富结点区域位于底物结合域和C端之间，间接干扰SFKs。

另外，在CHO 细胞中，p130Cas作用于FAK的下游来促进细胞迁移，在人胰腺癌细胞中作用于p130Cas和Crk之间来激活Rac，它是细胞迁移所必须的。

因此，FAK/p130Cas相互作用被考虑为细胞迁移的“分子开关”。

关于联合Src-Cas信号通路和podoplanin表达，Yongquan等人提出：podoplanin作用于Src和Cas 的下游，并且Src利用Cas来诱导podoplanin表达，从而促进肿瘤细胞迁移并导致癌侵袭和转移。

目前研究的目标是阐明podoplanin在肿瘤细胞迁移和侵袭中的分子生物学作用，通过在OSCC细胞系中刺激癌微环境生长因子如：bFGF，转化生长因子-β1（TGF-β1），HGF，PDGF和EGF，并检测Src-Cas信号通路。

材料和方法
细胞系和细胞培养
人类口腔鳞癌细胞衍生细胞系：Ca9-22，HSC-2，HSC-3和HSC-4。

每一细胞系在RPMI1640培养基中常规生长，添加100 U/mL青霉素-链霉素，10 U/mL两性霉素B和10%胎儿牛组血清，在潮湿环境中5% CO2，37°C。

实时定量RT-PCR
所有的RNAs利用哺乳类动物细胞蛋白和RNA提取器提取，在提取前在每一细胞系中加100ng/mLbFGF,TGF-b1,HGF,PDGF,和EGF过24小时和48小
时。

实时RT-PCR通过热循环实时系统完成。

one-step SYBR primeScript RT-PCR Kit II用于反应。

引物，源于podoplanin，MMP-2，MMP-2，MMP-2和甘油醛3脱氢酶（GAPDH）的序列，作为内部统一化控制，见表1。

每一PCR 混合物（最终反应容积20 μL）包含10.0μL One Step SYBR RT-PCR缓冲剂4，0.8μL PrimeScript 1step Enzyme Mix 2,0.8μL正向引物，0.8μL反向引物，7.6μLRNA和无菌水。

PCR条件：42°C / 5 min; 95°C / 10 s; 45 cycles of 95°C / 5 s,60°C / 30 s。

按照解链程序完成分离。

每个样本的RQ值根据双份测定并于GAPDH的平均值比较。

siRNA转染
siRNAs for podoplanin，c-Src siRNA和p130Cas与FuGENE转染剂以1:1稀释，并混合于RPMI1640培养基中。

苯丙醇2（PP2），一种Src的抑制剂这种化合物的原液来与二甲亚酚（DMSO）,储存与-80°C。

蛋白质印迹法（Western blotting）
细胞蛋白用PAREx提取，在提取前在每一细胞系中加100ng/mLbFGF,TGF-b1,HGF,PDGF,和EGF过24小时和48小时。

抑制配位测定，在podoplanin siRNA，c-src siRNA和p130Cas siRNA混合物中加入PP2-DMSO溶液，之前加入100 ng/mL EGF过24小时和48小时。

细胞溶解物被离心（at 12,000 rpm for 5 min at 4°C），上浮物被恢复用于蛋白质含量的测定。

等分的蛋白置于10%十二烷硫酸钠聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）,然后转移至聚偏氟乙烯膜，用1%牛血清白蛋白（BSA）固定。

膜中的特异蛋白被检测到，通过特异主要抗体一夜4ºC的潜伏期，之前加入特异二抗如抗鼠或抗兔结
合过氧化物酶和(DAB)/H2O2溶液过5-10分钟。

主要抗体见表2。

细胞迁移分析（scratch assay）
细胞系被播种于12-well的组织培养载玻片中（at 5 ×105 cells/well and 培养环境37°C for 24 h）。

一微升混合液（siRNA for podoplanin终浓度10 nM）用于每一well中并培养24小时。

在板的中心用吸管轻轻使一个scratch通过，细胞然后和EGF一起培养。

细胞移动通过scratch被观察，移动距离被测量在0小时和27小时。

结果
bFGF,TGF-β1,HGF,PDGF和EGF对podoplanin的表达的影响：为了调查哪种生长因子诱导podoplanin表达，我们选用bFGF,TGF-β1,HGF,PDGF和EGF加入Ca9-22，HSC-2，HSC-3和HSC-4细胞系中。

在所有OSCC细胞系中除了HSC-3细胞系，EGF和TGF-β1都增强了podoplanin mRNA和蛋白的表达（图1A,B）。

在HSC-3细胞系中，任何生长因子都未发现对podoplanin表达有显著影响。

EGF预处理48小时后的所有细胞系都增强了podoplanin表达，除了HSC-3细胞系（图2A,B）。

EGF对口腔癌细胞迁移的影响通过podoplanin和podoplanin特异siRNA 诱导：我们利用podoplanin特异siRNA分析功能缺失。

Bars表示细胞在0小时和27小时相对距离的移动。

每一Bar代表三次独立实验的mean±SD。

在HSC-2，HSC-3和HSC-4细胞系中podoplanin特异siRNA抑制细胞转移（图3A,B），其中的podoplanin蛋白表达也被抑制（图3C）。

EGF对MMPs mRNA的表达的影响：EGF预处理后在Ca9-22和HSC-2细胞系中增强了MMP-9 mRNA的表达，但没有改变MMP-2和MMP-7 mRNA
的表达，甚至在HSC-2，HSC-3和HSC-4细胞系中还减少了（图4）。

EGF和Src特异siRNA预处理后的OSCC细胞系中Src活力及它对podoplanin表达的影响：为了调查Src诱导podoplanin表达来促进细胞迁移，我们进一步调查了在OSCC细胞系中Src和podoplanin的联合表达。

在OSCC 细胞系中Src表达无处不在，并在EGF刺激下增强（图5A）。

Western blotting 分析也显示了Src被去磷酸化的Y527激活。

Src特异siRNA抑制podoplanin 表达尤其在Ca9-22和HSC-2细胞系中（图5B）。

EGF和p130Cas特异siRNA预处理后的OSCC细胞系中p130Cas活力及它对podoplanin表达的影响：在OSCC中调查Src和podoplanin下游的p130Cas。

在OSCC细胞系中p130Cas表达无处不在，并在EGF刺激下增强（图6A）。

p130Cas特异siRNA抑制podoplanin mRNA和蛋白的表达，尤其是在HSC-2细胞系中（图6B,C）。

PP2对podoplanin表达的影响：PP2是一种Src抑制剂，不影响Src本身的表达。

在所有OSCC细胞系中podoplanin表达以剂量依赖方式被抑制（图7）。

讨论
在生长因子关于受体酪氨酸激酶中，很少有研究联合HGF或PDGF和OSCC，来与EGF比较。

HGF的主要作用是在头颈部SCC（HNSCC）中作为旁分泌因子，HGF/c-Met通路频繁上调并在HNSCC中起作用。

在HNSCC中c-Src和c-Met的相互作用有所不同。

HGF促进有丝分裂并且是人类HNSCC细胞系的运动因子。

HNSCC细胞潜伏期HGF的存在可导致FAK和生长促进激酶Erk的磷酸化快速增长。

ERK MAPKs是一种丝裂原激活蛋白激酶，位于EGF,NGF和PDGF下游。

然而，我们目前的研究证明在生长因子关于SFK受
体中，只有EGF显著提高podoplanin表达，尤其是在48小时后。

而且，值得注意的是TGF-β1，它不是SFKs的一种，它是诱导EMT最广泛调查的细胞因子的一种，在它的表达中有显示了增长。

这一发现表明：在OSCC中可能存在通过TGF-β1的podoplanin依赖信号通路。

最近的研究以表明在角蛋白细胞中TGF-β1和STAT-3诱导podoplanin表达，这可能与伤口愈合的进程有关。

在OSCC中scratch assay和MMP mRNA表达实验证明了明显的podoplanin依赖细胞迁移。

MMPs由肿瘤和基质细胞分泌而来，在肿瘤侵袭和转移中发挥作用，通过降解肿瘤周围的细胞外间质（ECM），尤其是基底膜。

新出现的证据表明：MMPs能刺激EMT进程来增加肿瘤细胞侵袭和转移潜力。

大多数报道表明：MMP-2,-3和-9蛋白突出表达与预后不良有关。

MMP-9是IV型胶原酶，丰富存在于在基底膜中，并且癌的转移潜能可能与酶的降解级别有关。

在目前的研究中MMP-9的表达在被EGF处理的Ca9-22和HSC-2细胞系中有所增强，这与以前HNSCC的研究一致，表明随着钙黏着蛋白降解，进而MMP-9产生，激活EGFR从而促进细胞迁移和侵袭。

虽然新证据表明SFKs可能调停MMP活性，但更多研究阐明在OSCC细胞系中Src和MMP活性的关联是需要的。

podoplanin可能促进肿瘤侵袭，通过它本身具有促进肿瘤细胞肌动蛋白细胞骨架重建的能力，来促成他们能动性的增强。

podoplanin和肌动蛋白细胞骨架的联合似乎被埃兹蛋白介导，它在podoplanin过表达出现中被显著磷酸化。

我们的一系列研究关于EGF-Src-Cas-podoplanin信号通路已经揭示了口腔癌细胞中Src和p130Cas的表达无处不在。

Src和p130Cas的激活对podoplanin 的表达很重要。

因此，podoplanin利用Src和p130Cas来改变肿瘤细胞骨架，
并可能于口腔肿瘤细胞侵袭有关。

podoplanin的生物学功能可能在不同种类的癌中有所改变。

据报道podoplanin能诱导Rho A的活性和MDCK细胞中的EMT,然而它在乳腺肿瘤细胞系中减弱Rho A的活性且不诱导EMT。

这些对立的发现表明podoplanin的生物学功能具有细胞类型特异性。

我们实验研究的结果表明在口腔癌进程中podoplanin的表达促进细胞迁移，并且EGF-Src-Cas通路（图8）是机制之一。