微卫星详细实验流程

PUC18/PUC19(2686bp)
58.8nmol/l
（4） 温育结束后，在 5mmol EDTA 存在（PH8.0）下，于 75℃加热 10min 或 65℃加热Βιβλιοθήκη 1h 以灭活 CIP,然后用酚：氯仿抽
提，纯化 DNA。
（5） 使反应温度降到室温，用酚：氯仿：抽提 2 次。加入 0.1 体积 3mol 乙酸钠（pH7.0）,充分混匀， 2 倍体积的乙醇
5’突出端
平端或凹端
CIP 需求量
1 单位/100pmol
1 单位/2pmol
温育条件
37℃ 30 分钟
37℃15 分钟 （然后加入另一小份 CIP,继 续于 55℃温育 45 分钟）
DNA 在溶液中的摩尔浓度
双链 DNA（50μg/ml）
末端的 DNA 浓度
PBR322(4363bp)
36.2nmol/l
以少数几个核背酸 ( 多数为 2-4 个 ) 为单位多次串连重复的 DNA 序列。也称为简单序列重复 (simple sequence repeats,SSR) 、短串连重复 (short tandom repeats) 或简单序列长度多态性 (simple sequence length polymorphism) 。微卫星标记是随 PCR 技术而广泛应用起来的 , 由于其序列简短 , 通 过 PCR 很容易从基因组 DNA 中特异性地扩增出来 , 大大简化了微卫星多态性分析的操作。研究者只需在 目标基因座设计一对或多对引物 , 通过 PCR 反应从模板 DNA 中将该基因扩增出来 , 然后进行电泳分 离 , 染色显带即可 , 无需探针和同位素标记以及分子杂交等繁琐操作。微卫星分子标记的另一优点是在 基因组中分布广泛 , 而且多态性丰富。研究表明 , 在真核生物中大约每隔 10~5okb 就存在一个微卫星 , 哺乳动物基因组中约有 (5~10) × 10 4 个这种微卫星 ; 而且呈等显性遗传 , 可以从电泳结果中直接区 分纯合体和杂合体基因型。因此 , 这种分子标记已被广泛应用于构建基因图谱、种质鉴定、亲缘关系分析、 分子标记与经济性状关系分析及遗传疾病诊断。 三:如何开展 STR 技术
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1、碱裂解法小量制备质粒
（1） 挑取划板后的单菌落，接种到 2mL 含有适当抗生素的丰富培养基中（我们用 LB 培养基），于 37 ℃剧烈振摇下培养过夜。
（2） 将 1.5mL 培养物倒入微量离心管，用微量离心机于 4℃以 10000 转离心 5 分钟，剩余的培养物贮存 于 4℃。 （3） 离心结束，尽可能吸干培养液。 （4） （此步可选用）用冰预冷的 STE（菌液体积的 1/4）重悬细胞沉淀并离心（10000 转 5 分钟）。 未从细菌沉淀中除去所有培养液的后果是质粒不能被限制性酶切割或不能完全切割。这是因为培养液中的
何为 STR 技术？原理与应用？如何开展 STR 技术？需要哪些仪器设备？有哪些公司可支持 STR 技术 的开展？ 一:定义
微卫星（microsatellite analysis）即短串联重复(Short tandem repeat，STR)，它是由 2-6bp 重复单位构成 的 DNA 序列，通常多态性片段长度在 100-300bp。以人类基因组为例，平均每 15-20kb 就存在 1 个 STR 座 位，据此估计整个人类基因组中大约有 50,000-100,000 个 STR 位点。由于它具有高度的多态性和遗传稳定 性，所以非常适合作为遗传学 DNA 分子标记，目前 STR 分析已广泛应用于遗传制图、连锁性分析、亲子 鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域。 二:原理及应用
25mmol Tris.Cl(pH8.0)
10 mmol EDTA(pH8.0) 此溶液一次可配制 100ml,在 1.05kg/cm2高压下蒸气灭菌 15 分钟，贮存于 4℃
（6）
加 200μL 新配制的碱裂解液Ⅱ与每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合
内容物，且勿震荡，将离心管室温放置 5 分钟。
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1、 载体的去磷酸化：去磷酸化后使线状质粒 DNA 的转化率降低至最多不超过原来的 1/50 2、 感受态细胞的转化效率：每微克超螺旋质粒DNA应产生 1X106—2X107个转化菌落。 3、 蔗糖密度剃度离心筛选的 DNA 片段大小在 250－700bp。
三、实验步骤：
（一） 质粒载体的制备 本实验所用的质粒为 pGEM-3zf(+),此质粒为氨苄青霉素抗性，以松弛方式进行复制。
（9） 加等量体积的酚：氯仿，震荡混合有机相和水相，然后用小离心机于 4℃以 4000 转离心 5 分钟，将上清转移至另
一离心管中。
（10） 用 2 倍体积的乙醇于室温沉淀核酸，振荡混合，于室温放置 2 分钟。 （11） 于 4℃，12000g 离心 15min，收集沉淀。 （12） 小心倒出上清液，将离心管倒置于纸巾上。
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（13） 加 500 微升 70%乙醇于沉淀中，于 4℃12000g 离心 5min。 （14） 倾去上清，除去管壁上的酒精液滴,将开口的试管置于室温使酒精挥发，直至试管内没有可见的液体存在。 （15） 用 30 微升含有去 DNA 酶的 RNA 酶 A(20μg/ml)的 TE 重新溶解核酸，温和振荡几秒钟，贮存于-20℃。
（2） 消化完全后，用酚：氯仿抽提样品，用 2 倍体积的乙醇于 0℃沉淀 DNA15min，然后用微量离心机于 4℃12000g 离 心 10min，回收 DNA,用 90μl 10ｍＭ Tris·CL（pH8.0）重溶 DNA。取出一小份 DNA（200ng）贮存于-20℃。 （3） 在剩余的 DNA 中加入适量的 10XCIP 去磷酸化缓冲液和适量的 CIP,在适宜的条件下温育。
连接反应 C:200ng 未经 CIP 处理的线状质粒 DNA
（2） 建立 20μl 的反应体系
（3） 一个连接反应管内加 0.5U 的 T4 DNA 连接酶，于 15℃温育 10-12 小时。
（4） 各连接反应中各取 50ng 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，用一已知量闭环质粒的标准溶液转化大肠杆菌，作为阳
性对照。从每个转化反应中各取 100μl 铺于含氨苄青霉素的平板上，于 37℃过夜培养后，计算每个平板上的菌落数。去磷酸
化使线状质粒 DNA 的转化率降低至最多不超过原来的 1/50（连接反应 C 与 A 之比为 50），所以外源 DNA 与去磷酸化的线
状质粒 DNA 的连接（连接反应 B）成功后，转化率至少可提高至原来的 5 倍（连接反应 B 与 C 之比为 5）。
添加 50~100µl 的裂解液;
（3） 消化的样品加入 1:1 的酚:氯仿,缓慢地颠倒离心管 30 分钟，混合两相。5000 转离心 10min 以分离两相;
细胞壁成分抑制多种限制酶的活性。
STE: 10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)
0.1molNaCl
1mmol EDTA (PH8.0) 在 1.05kg/cm2高压下蒸汽灭菌 15 分钟，贮存于 4℃
（5）
将细菌沉淀重悬于 100μL 冰预冷的碱裂解液Ⅰ中，剧烈震荡。冰浴 5min。
裂解液Ⅰ： 50 mmol 葡萄糖
裂解液Ⅱ： 0.2mol NaOH
1%(W/V) SDS
用 10molNaOH 和 10% SDS 新鲜配制
（7） 加 150µl 用冰冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中混匀，冰浴 5min。
裂解液Ⅲ： 5mol 乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水
28.5ml
（8） 用小离心机于 4℃以 12000 转离心 5min，将上清液转移到另一离心管中。
沉淀，充分混匀后于 0℃放置 15min。用微量离心机于 4℃12000g 离心 10min。用预冷的 70%乙醇洗沉淀 1 次，再进行离心。
用 TE 重新溶解沉淀的 DNA，贮存于-20℃。
4、连接预试验和转化
（1） 建立下面的连接反应：
连接反应 A:200ng 去磷酸化的质粒 DNA;
4
连接反应 B:200ng 去磷酸化质粒 DNA 加 200ng 带磷酸化的匹配末端的外源 DNA 片断；
3'-C C T A GΛG-5' Ⅰ.限制性内切酶消化 DNA 样品的反应模式： （1） 混合下列溶液于一个无菌离心管中
xµｌ DNA（0.1－4µｇ,溶于水或 TE 中） 2 µｌ 10X 酶切缓冲液 yµｌ内切酶 18- xµｌ-yµl H2O 20µｌ反应体积可以方便的用于琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯凝胶电泳分析。只要反应混合物中其他成分的比例保持一定，可 增减待切割 DNA 的量和（或）反应条件。 （2） 加入限制性内切酶（1－5U/µｇDNA）混匀，于 37℃温育 1－4h。 理论上，1U 的限制性内切酶在推荐的反应条件下，1h 内可完全消化 1µｇ纯化的 DNA 样品。酶的体积应低于反应总体 积的 1/10，因为酶液中的甘油干扰反应的正常进行。 （3）加入 5µｌ电泳加样缓冲液（20％反应体积）终止反应，进行琼脂糖或聚丙烯酰氨凝胶电泳。 反应也可通过加入 0.5µｌ 0.5M EDTA(终浓度为 12.5mM)以螯合镁离子而终止。很多酶在 65℃温育 10 分钟可被不可逆失活， 有些不能在 65℃热失活的酶在 75℃温育 15 分钟也能失活。如果酶对热有完全抗性，可通过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质 悬浮法来纯化 DNA。 Ⅱ. 用限制型内切酶 Bam HI 消化质粒 pGEM-3zf(+)： （1） 用分光光度计或标准琼脂糖电泳法检测所提取质粒的浓度 （2） 按照上述模式建立反应体系 （3） 37℃水浴温育 3－4h。 （4） 从水浴锅中取出样品，取出部分消化产物电泳检查消化程度（用未消化的质粒和标准 marker 作参照物），其余样 品放在 4℃冰箱中。如果酶切不完全，在剩余样品中加入少量酶继续消化，直至消化完全。 （5） 在消化好的样品中加入等体积的酚、酚：氯仿抽提 2 次，乙醇沉淀。 因为 10U 的 Bam HI 在 80℃温育 20 分钟只有很少量的酶失活，因而不用加热失活的方法。 4、 线状质粒 DNA 的去磷酸化 小牛肠碱性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP 或 CIP）和细菌碱性磷酸酶（Bacteria Alkaline Phosphatase,BAP） 都能催化水解 DNA、RNA、dNTP 和 NTP 上的 5’磷酸残基。而小牛肠碱性磷酸酶（CIP）是从线状 DNA 上去除 5’磷酸基 团时首选的酶。本实验用 CIP 去磷酸化。 （1） 取小量用限制酶消化的闭环 DNA 在 0.8%的琼脂糖凝胶电泳上检查消化程度（用未消化的质粒 DNA 作标准参照物）。 如果消化不完全，加大酶量继续温育。
（二）短链 DNA 片段的制备
1、高分子量基因组 DNA 的提取
（1） 剪取新鲜的鳍条或其它组织 0.1ｇ，放入 10 倍于样品体积的裂解液(0.5%十二肌胺酸钠;200µg/ml 蛋白酶 K;0.5M 的
EDTA)的离心管中,离心管放在冰上效果会较好;
（2） 于 50℃的保温箱中消化 1~2h,并不时轻轻摇动，至组织完全消化后取出;如果 1h 后仍有大量的样品未消化，可酌量
(一)、微卫星的制备主要包括：提取目标生物高分子量的基因组 DNA，用 Sau 3A I 酶切获得短链 DNA
（250-700bp） 、蔗糖密度剃度离心筛选大小适宜的片断、制备载体、构建重组质粒、感受态细胞的制备及 重组质粒的转化、将含重组子的菌落转移至硝酸纤维素膜上、杂交、挑取阳性克隆、测序。具体实验流程 见下图： (二)、本实验的关键技术
LB(Luria-Bertani)培养基： 配制每升培养基，应在 950ml 去离子水中加入： 胰化蛋白胨 16g 酵母提取物 10g
NaCl 5g 摇动容器直至溶质溶解,用 5N NaOH 调 pH 值至 7.0 ,用去离子水定容至 1L。在 1.05kg/cm2 高压下蒸汽灭菌 20min。 2、用限制性内切酶 Bam HI 消化质粒 此酶的识别位点为 5'-GΛ G A T C C-3'