昆虫线粒体基因组研究方法

4. 设计引物，扩增其他片段 • 利用软件Primer5.0 设计引物，扩增其他片段。最 难扩增的片段是控制区（A+T-rich）。因为引物 很难设计，所以需要花费一些时间及精力。
5. 将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形）
• 利用软件DNAstar对扩增好的各个片段进行 拼接。用Bioedit软件查看测序原始峰图， 校对各个碱基。将校对好的数据上传至 Genbank。获取Genbank的accession • number。
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具体步骤
• • • • • • 1. 采集标本并冷冻 2. 提取DNA 3. 扩增线粒体基因组上的经典片段 4. 设计引物，扩增其他片段 5. 将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形） 6. 校对数据，利用软件、比对等方法，标出tRNA、 16S、12S及13个蛋白质基因的位置，上传线粒 体基因组数据至Genbank。 7. 对tRNA进行结构预测 8. 对12S及16S进行结构预测 9. 对该昆虫线粒体基因组上特殊位置进行讨论 10. 系统发育分析
• 用软件XRNA进行预测。 预测不到的，用手工 画出。
8. 对特殊结构进行分析讨论
• 例：控制区的结构分析 • 在线软件 Mfold Web Server (Zuker, 2003; http://mfold.rna.albany.edu/?q =mfold)
9. 系统发育分析
• 用软件MEGA5.0， RAxML,Paup4.0,mrba yes等软件进行分析
• • • •
1. 采集标本及冷冻 利用高压汞灯及黑光灯诱集，然后将标 本低温冷冻致死，取一侧后足泡入无水乙 醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。标 本展翅并保存，以待进一步形态鉴定。
2. DNA提取 • 总DNA提取试剂盒为德国默克公司 QIAGEN DNeasy Tissue kit。PCR试剂使 用TIANGEN天根生化科技有限公司生产的 PCR MasterMix。 • 将浸泡于无水乙醇中的足取出，晾干， 分成2-3段，放在1.5ul的离心管中。按照 QIAGEN DNeasy Tissue kit使用手册的说 明进行总DNA提取。抽提的DNA溶于200300ul的AE缓冲液，并置于在-20℃冰箱保 存备用。
6. 寻找tRNA及预测tRNA结构
• 用tRNAscan-SE Search Server 在线软 件，寻找tRNA，一次 可找出17-19个。其余 与其他昆虫线粒体进 行比对找出。 • 用DNAsis预测tRNA结 构，对于较为特殊的 tRNASer(AGN)，需手 工画出。
7. 预测12S及16S结构
昆虫线粒体基因组研究方法
一. 昆虫线粒体基因组的研究意义 • （一） 适合做进化生物学研究。被广泛用 于研究基因组结构和功能、群体遗传结构， 谱系地理学和各种分类学水平上的系统发 育关系研究。 • （二）功能基因的研究
二. 研究方法 • • • • （一）获取待研究昆虫的线粒体基因组 （二）对线粒体基因组结构进行分析 （三）与其他昆虫线粒体基因组进行比对 （四）进行系统发育分析
3. PCR扩增和测序
• 先扩增线粒体基因组上的经典片段，如COⅠ、COⅡ、 COⅢ、Cob等。 • 例：扩增COI基因片段 • 扩增引物为通用引物LCOI490（5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’）和 HCO2198（5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’）（Folmer et al , 1994）。反应体系为25μl，其中上下游引物各0.5μl， PCR MasterMix 12.5μl ，DNA模板3μl，ddH2O 8.5μl。 扩增反应条件：预变性94 ℃ 2分钟，变性94℃ 1分钟，退 火50 ℃ 1分钟，延伸72 ℃ 1分钟, 进行35个循环。取3μl PCR扩增产物使用1%的琼脂糖胶电泳检验。PCR产物测 序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。