专题 核酸的生物合成及化学合成

B
GP-O
O
HH
H O
HH
OPO
O
PG
O Ph S Cl
O
- HCl
B
PGO
O
HH
- Ph-SO3-
H
H
OH
O P O-PG
B
O
O
HH
H
H
OPG H
B
GP-O
O
HH
H
H
OH
OP O
O PG
B
HO
O
HH
H
H
OH
PG
O S Ph O
z 常使用的芳基磺酰氯
SO2Cl
SO2Cl
H3C
CH3 (H3C)2HC
z d. β－氰乙基 -CH2CH2CN
z 用温和的碱或F-去除磷酸氰乙基酯保护基
O HN
ON
GP O
O
HH
H
H
OH O
NC-H2C-H2C O P
HN ON
O
O
HH
HO HH
PG
2. 磷酸酯键的形成
z 与肽键的形成相似，核苷酸之间形成磷酸酯键需要消 耗能量。因此形成磷酸酯键过程中，必须提供反应所 需要的自由能.
异丁氧羰基 (isobutyloxycarbonyl)
z 此酰氨键耐肼解，易被浓氨水除去。
B. N,N－二甲氨亚甲基
z 胞嘧啶核苷与N,N-二甲基甲酰胺缩醛作用生成shiffs base
上述反应包括了亲核取代和一个活性中间体转变 过程
在酸或碱条件下脱去保护基。
胸腺嘧啶T、 尿嘧啶U核苷
与二甲氨基甲酰胺缩醛反应得到氨基甲基 化产物。
z 过量硅烷化剂对第二-OH也有作用， z 硅烷化试剂对碱基上氨基无明显作用. z 硅醚对碱和肼稳定, 对酸比较敏感。
选择性保护
不同羟基的硅烷基化产物对酸的敏感程度不同。叔丁基二甲基 硅烷基与第一醇羟基形成的硅醚在酸性条件下最容易除去。
D. 四氢吡喃基 Tetrahydropyranyl (THP)
z 特点：合成过程中磷酸始终以二酯键形式存在。 所以磷酯键总是带一个负电荷（磷酸根第三个 －OH电离所致）随着多聚荷苷酸连的增长， 负电荷数增多。这些亲核的负离子有可能参加 副反应，并使产物极性过大，使一般技术难以 纯化分离。
z 所以二酯途径只能合成质量较小的多聚核苷酸。
（II）磷酸三酯途径合成法：
z 特殊酰基保护基：选择性保护与脱去
z 三氟乙酰基，CF3COz 苯氧乙酰基，PhOCH2COz 甲氧基乙酰基，CH3OCH2COz γ－酮酰基，R-CO-CH2CH2COz 烯酮酰基 R-CH=CH2-COz 均比乙酰基更易除去。
γ－酮酰基在中性条件下，用水合肼可方便除去。
丙烯酰基(acrylyl)与γ－酮酰基类似, 用水合肼可 方便除去。
O
HH
HO HH
Cl
Cl3C-CH2O P Cl
O HN
ON
HO
O
HH
HO HH
O
PG
HN
ON
GP O
O
HH
HO HH
Cl3C-CH2O P Cl
Cl3C-CH2O
HN P
ON
O
O
HH
HO HH
PG
3,5-亚 磷 酸 三 酯 产 物
用金属锌粉 去除磷酸三氯乙基酯保护基
c. 芳基
Cl
RO
OH
Cl P
O
Ph H H
HO HH
NC-H2C-H2C O P O O
HO
O
HH
HO HH
PG
2. RNA的生物合成
RNA的功能是传递和表达DNA的遗传信息。 实际上所有RNA都是由DNA链为模板, 在RNA聚合酶
的 作 用 下 合 成 的 。 这 种 RNA 的 合 成 过 程 叫 做 转 录 transcription。 z 从大肠杆菌分离得到了RNA聚合酶（RNA polymerase）. 可以在一定条件下催化合成RNA链。 z (1) DNA模板：双螺旋DNA或单链DNA，RNA本身不可 以。 z (2) 四种活化的核苷酸单体: ATP、GTP、CTP、UTP z (3) 一定浓度Mg2+的存在
z 碱基上游离的NH2 z 糖的2’-OH，3’-OH，5’-OH
z
（特别是2’，3’-OH选择性保护，非常困难）
z 磷酰基中的游离羟基
（1）碱基中游离NH2的保护
z 腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C含游离环外－
NH2 z 磷酰化时可能生成不需要的磷酰氨基所以事
先保护。
z 保护基：酰基（RCO-）;
z
(4）需要一定浓度Mg2+的存在
引物链
O
H2C
O 碱基
HH
模
H
H
引物链
O
H2C
O 碱基
HH
模
H
H
HO H
OH
板
PPi -O P O
板
OOO
-O P O P O P OO- O- O
链
H2C
O 碱基
HH
H
H
O
H2C
O 碱基
HH
链
H
H
HO H
HO H
由DNA聚合酶 催化的链延长反应
链的增长反应是引物DNA的3’-OH对脱氧核糖核苷三磷酸的 α-磷原子亲核进攻的结果。DNA链增长的方向是5’ 3’。
z 三苯甲基正离子由于空间效应，很难与 第二醇反应, 所以具有良好的选择性。
z 脱去方法： z 80％乙酸 z 或Py-乙酸处理，即可除去。
B. 酰基：
z 酸酐或酰氯在吡啶存在下，可以使核糖 的第一和第二羟基酰化。碱基上有氨基 也可同时酰化。
z 常见酰基：甲酰基、乙酰基、苯甲酰、 氯乙酰基
z 需要在碱性下均可脱去，选择性较差。
p-CH3O-PhCO- (anisoyl )
如腺嘌呤核苷：
鸟嘌呤G中氨基保护
鸟嘌呤G中氨基保护与A相似，只是糖上脱酰基条件略 有不同。
NaOCH3/Py 四苯甲酰-鸟嘌呤 -------------------- N-苯甲酰-鸟嘌呤
N
N HO
O HH HOH OHH
O NH
OO Ph-C-O-C-Ph
它能将脱氧核糖核酸逐个连结成DNA链。
大肠杆菌中还发现了另外两种DNA聚合酶，分别为 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，功能与Ⅰ相似。
DNA聚合酶I催化合成DNA链必须具备下列条 件： （1）4种脱氧核糖核酸单元必须是活化形式
dATP dGTP dCTP dTTP （2）一条DNA单链作为DNA合成模板（DNA Template） （3）一个引子DNA（primer DNA）
B
HO
O
HH
H O
OH
H3C CH3
缩醛
苯甲酮、环己酮、原甲酸酯可代之。
（3）磷酸酯基保护
z 磷酸为三元酸，在多聚核苷酸的磷酸酯中自然 存在一个游离的酸性羟基，常常以解离形式存 在，形成带负电荷亲核中心，易导致副反应， 使合成核酸分子极性增大分离纯化有困难。
z 磷酸保护基主要有以下几类： z a. 甲酯类： z 甲醇与亚磷酸酰氯作用，生成单甲基亚磷酰氯
DNA及RNA的化学合成
z 是相当复杂的问题，与合成多肽类似， 必须按特定的设计顺序，把核苷酸单体 偶联起来。
z A. 需要对不参加反应的基团进行保护， 防止副反应；
z B. 还要将参加反应的基团活化, z C. 最后还要脱保护， z D. 每一步反应要求具有高的产率。
1. 保护基：
需要保护的基团：
SO2Cl CH(CH3)2
CH3
Ts
CH3
MS
CH(CH3)2
TPS
O
MMT
Ph
HN ON
H3C-O-Ph C O
O
Ph H H
H OH H H
O
HN
Ph
ON
H3C-O-Ph C O
O
Ph
HH
HO HH O
O
O NC-H2C-H2C O P O
O
O HN ON
HN
MS/Py
Ph
ON
H3C-O-Ph C O
z 提供外加能量的方法主要有两种。 z 一是将磷酰化剂活化----磷酰氯 z 二是加入偶合剂如DCC等。 z 一般来说，核苷中的5’-OH比较活泼（第一醇）易磷
酰化，所以通常是使核苷的3’-OH磷酸酯与另一核苷 5’-OH形成磷酸二酯键。
合成多聚核苷酸有两条途径 （I）磷酸二酯键法 （II）磷酸三酯途径合成法：
z 磷酸三酯法：核苷酸在进一步反应之前 先将磷酸酯中的一个游离-OH保护。这 样所形成的核苷酸之间形成的磷酯桥实 际上是一个磷酸三酯，待聚合反应完成 后再除去磷酸保护基，这样就解决了磷 酸酯带负电荷的问题。
z 偶联剂主要是TPS、MS，此法合成分子 量较大核苷酸。
z 芳香酰氯合成法 效果很好
z 可用于磷酸二酯键合成产率很高，也可用于磷 酸三酯键合成。
专题1：多聚核苷酸的生 物合成及化学合成
展鹏
山东大学药学院 无机化学教研室
2011-11-2
多聚核苷酸的生物合成
1. DNA的生物合成
即DNA的复制过程。
A：双股DNA
单股DNA
B: 以DNA为模板, 合成新的DNA
1958年Komberg.A从大肠杆菌中分离出一种酶，能 催化合成DNA——DNA聚合酶I（DNA polymerase I) (103aa多肽酶）
B
(Ph)3C-O
O
HH
H O
HH
OPO
O
N
B
C N
Py (Ph)3C-O
O
HH
H O
HH
NH
OPO
C
O
N
B
HO
O
HH
1 OH-
H O
HH
OPO
B
O
O
HH
H
H
OH H
2.H+
B
HO
O
HH
HO HH
PG OCH3
反应速率缓慢及伴随副反应较多，实际应用少。
z 磷酸二酯法：用DCC做偶联剂生成磷酸二酯键 法属于该类.
O
N
NH
N NH2
PhCO O
NN
O HH
HO OH
COPhCOPh
NH COPh
O
N
NH
甲 醇 钠 /吡 啶
N N NH COPh HO
O HH HOH OHH
胞嘧啶核苷上氨基
可用苯甲酸酐直接酰化, 糖上OH不受影响
所有酰基保护基通常用氨水或NaOH水解除去。 苯甲酰基可用NH2NH2解去除，而在此条件下， 核糖上酰基可保留。
HH
(2) Recrystallization
H
H
OH
OCOR
OCH3
B
R'COO
O
HH
H
H
OH
OCOR
1. O
2. NH3
B
HO
O
HH
H
H
OH O OCH3
O
E. 2’-,3’-OH同时保护法
z 2’-,3’-OH同时处于顺式可用丙酮保护。
B
HO
O
HH
H OH
OHH
+ CH3 C CH3 O
对酸敏感, 而去除
（I）磷酸二酯键法
（1）磷酰氯法 z 温和条件下 核苷与磷酰氯反应生成了
5’-磷酸核苷(90%) 或 3’-磷酸核苷
B
HO
O
HH
H
H
OH
+ POCl3
O
B
Cl P O
O
Cl
HH
H OH H
H2O
O
B
HO P O
O
OH H H
H
H
OH
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
z （2）DCC法： z DCC与单磷酸酯反应，活化了单磷酸酯中间体。
z 碳酸酯基也可用于核糖-OH保护. z 如氯甲酸异丁酯 (isbutyl chloroformate)
酸性下稳定, 碱性下被除去。 也可用于2’,3’-OH 的保护（ 5’-OH已被保护 ）。
C. 叔丁基二甲基硅烷基 z (CH3)3C-Si(CH3)2
z 具有选择性保护核糖-OH, 主要在第一醇 羟基上保护.
(2) 糖-OH保护
脱氧核糖有两个-OH: 3’-OH ; 5’-OH z 核糖有三个-OH: 2’-OH; 3’-OH; 5’-OH
z 在多聚核苷酸合成过程中，必须选择性引 进或脱去保护基。
z 所以糖羟基保护基选择性就显得非常重要。
HO
B
O
HH
HOH H
HO
B
O
HH
HOH OHH
A. 甲氧基三苯甲基保护基
z 四氢呋喃主要与糖2’-OH保护，对RNA 合成有重要意义。
+ R-OH O
2,3-二氢吡喃
O OR 四氢吡喃醚
对碱稳定，酸中可除去。
THP保护2’-OH 过程
B
HO
O
HH
H OH
OHH
B
(1) RC(OMe)3 (2) R'COOCOR'
R'COO
O
HH
H O
OH
B
R OCH3
R'COO
O
(1) H+
N,N-二甲氨亚甲基衍生物
z
[(CH3)2NCH(OCH3)2]
z A．酰基 NH2上酰化后，降低了亲核性。
z
是保护NH2的主要方法。
z 在这个过程中糖上OH，也被酰化，所以酰化
后要选择性去酰基，即糖上选择性脱酰基。
z CH3CO- (Acetyl)， z C6H5CO- (Benzoyl)， (CH3)2CHCO- (isobutyryl)，
Cl
O
HN
ON
GP O
O
HH
H OH H H
RO O
HN
ON
GP O
O
HH
H
H
OH O
HN
RO
OP
ON
Cl
RO
OP
Cl
单芳基磷酰二氯
O
Cl OP
Cl
HN
ON
GP O
O
HH
HO HH
RO
OP
O
Cl
HN
ON
HO
O
HH
HO HH
PG
O
O
HH
HO HH
PG
3,5-亚 磷 酸 三 酯 产 物
z 用F-/OH- 去除磷酸芳基酯保护基
z 单甲氧基三苯甲基 MMT z 双甲氧基三苯甲基 DMT z 三甲氧基三苯甲基 TMT z 特点：选择性保护第一醇(伯醇)羟基: 5’-OH z 在温和条件下只有极小量第二醇羟基或碱基
上的氨基与单甲氧三苯甲基氯作用。
z 机理：SN1机制进行. z 反应速率: DMT > MMT > Trityl
甲基亚磷酰氯
--------
质子化的 活性中间体
二异丙基胺 3’-亚磷酰胺
硫粉祛除磷酸甲酯保护基
z b. 2,2,2-三氯乙基：-CH2-CCl3
Cl3C-CH2OH
Cl Cl P
Cl
Cl
Cl3C-CH2O P Cl
O
（保护基引入磷酰化剂）
O
HN
ON
GP O
O
HH
H OH H H
O
HN
ON
GP O