兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其免疫原性检测

收稿日期:2006211214
基金项目:国家自然科学基金资助项目(3067114,30740077);山
东省自然科学基金资助项目(Y2006D09) 作者简介:王　伟(19812),男,在读研究生。

3通讯作者,E 2mail :zhurl @
兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其免疫原性检测
王　伟1,朱瑞良13,李新苍1,胡晓娜1,王永花2　(1.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;2.上海
美农公司,上海201000)
摘要:2004年,山东省某一大型养兔场的20～30日龄幼兔突然大批发病死亡。

病兔早期精神不振,多数病兔鼻腔流出脓性鼻液,随着病程的延长逐渐表现为呼吸困难,并出现鼻鼾声,以体况瘦弱,腹泻为主要症状。

从中主要分离到4株细菌,根据其形态学特性、培养特性、生化特性、血清学反应特性等将分离菌鉴定为兔支气管败血波氏杆菌。

然后对所分离到的兔支气管败血波氏杆菌菌株进行(G +C )mol %含量的测定以及16SrRNA 的扩增,结果(G
+C )mol %含量为61.7%～62.4%,与Kersters K 结果相符(61.6%～62.6%);而该菌16SrRNA 核苷酸序列与GenBank 中收录的AF177666株禽波氏杆菌核苷酸序列同源性为82.7%,与本实验室保存的禽波氏杆菌及兔败血
波氏杆菌参考菌株S80103株同源性高,分别为99.7%和99.9%。

利用所分离到的兔支气管败血波氏杆菌菌株制备免疫原,通过免疫孕前母兔,使仔兔获得母源抗体,而使幼仔兔获得早期保护,效果较好。

关键词:兔;波氏杆菌;鉴定;(G +C )mol %;16SrRNA ;免疫
中图分类号:S852.61 文献标识码:A 文章编号:100524545(2008)0820897204
Isolation ,identif ication and molecular biology characterisitics of rabbit Bor det
ell abronchise ptica
WAN G Wei 1,ZHU Rui 2liang 13,L I Xin 2cang 1,HU Xiao 2na 1,WAN G Y ong 2hua 2　(1.College of A n 2
i m al H usband ry and V eteri nary M edici ne ,S handong A g ricult ural U ni versit y ,T ai an ,S han 2dong 271018,Chi na;2.S hang hai Mei non g Feed Co ,L t d ,S hang hai 201000,Chi na )
Abstract :In 2004,the 20,302day 2old young rabbits of a large 2scale farm in Shandong were diseased suddenly and
were caused to death.The rabbits discharged the purulent nasal secretion in early phase ,and with the process of dis 2ease ,the rabbits manifested the dyspnea ,snore ,feebleness ,and diarrhea.Four bacteria were isolated ,and through morphological ,cultural ,biochemical characteristics and serial reactional traits ,the bacteria were identified as rabbit B ordetella bronchise ptica .The G +C mol %of isolated bacteria was from 61.7%to 62.4%,which accorded to the
results of Kereters (61.6%262.6%);the homology of gene sequnence of 16srRNA from the isolated strains with the corrensponding parts of avian B ordetella bronchiseptica recorded in G eneBank was 82.7%;and the homology of gene sequnence of 16srRNA with the corrensponding parts of Avian strian and rabbit B ordetella bronchise ptica Ref 2erence strian A F177666was higher ,which was 99.7%and 99.9%,respectively.The immunogens were prepared u 2sing the isolated bacteria ,and the female rabbits were vaccinated before pregnancy.The new 2born rabbits showed the high titer abtibody and the good protection against rabbit B ordetella bronchiseptica .
K ey w ords :rabbits ;B ordetella bronchise ptica ;idenfiction ;(G +C )mol %;16SrRNA ;immune 3Corres ponding author ,E 2mail :zhurl @
兔支气管败血波氏杆菌病是家兔常见的传染病,主要引起哺乳仔兔和断乳仔兔的急性死亡,成年兔的鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎等,对养兔业造成很大的危害[122]。

2004年,山东省某一大型兔场及
其周围养殖户饲养的新西兰肉种兔2400余只,其所产仔兔共计465只,均在20～30日龄发病,表现为精神不振,多数病兔鼻腔流出脓性鼻液、周围的被毛沾有粘液脓性分泌物,后期出现结痂,随着病程的延长逐渐表现为呼吸困难,并出现鼻鼾声,体况瘦弱,下痢拉稀。

从病兔肝脏中分离到4株革兰氏阴性菌,经鉴定均为兔支气管败血波氏杆菌,现将该菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究情况报告如下。

1　材料与方法
111　被检病料及被检血清　病兔的鼻腔分泌物、肝脏、脾脏、肾脏、血清等病料,均采自于山东某兔场的同一批发病或死亡的幼兔。

病兔初期主要表现为鼻腔流出少量浆液性或黏液性分泌物,后期呈脓性分泌物,呼吸困难,食欲不振,逐渐消瘦。

剖检表现为鼻腔粘膜及气管粘膜出血,鼻腔、咽喉部及气管内充满淡黄色粘液性或脓性分泌物,肺充血水肿,表面有大小不一的化脓灶,切开后有乳白色的脓汁流出,一侧肺的尖叶部分发生肉变,另一侧肺呈灰白色坏死,切面有大量白色干酪样物质;肝肿胀、淤血,质地坚硬,肝表面有少量细小的坏死点,有的病例脾脏边缘有坏死、肿大;胃底粘膜轻度出血;肠粘膜充血、出血、水肿变厚,直肠变厚。

1.2　培养基　普通营养琼脂、麦康凯、普通肉汤培养基,购自天津市珠江卫生材料厂。

细菌生化微量反应管,购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3　参考菌株及阳性血清　兔支气管败血波氏杆菌参考菌株S80103株及其阳性血清是由扬州大学兽医学院微生物实验室惠赠。

大肠杆菌的阳性血清、鸡白痢沙门菌阳性血清、新城疫阳性血清及禽流感阳性血清,均购自中国兽药监察所。

1.4　药敏纸片　常见药物的药敏纸片,购自上海医学化验所。

1.5　试验用兔　购自泰安市郊区种兔厂。

1.6　化学试剂　10#白油由杭州炼油厂生产,硬脂酸铝由上海远航化工厂生产,Tween280和Span280由上海大众制药厂生产。

1.7　分子生物学材料　小量细菌总DNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒和小量质粒抽提试剂盒均购自上海华舜公司;TaqDNA酶、pMD182T载体、Bam HⅠ、HindⅢ,均购自大连宝生物工程公司;
E.coli T GⅠ由本实验室保存;其他试剂均为分析纯试剂。

1.8　细菌的分离及鉴定
1.8.1　细菌分离培养　无菌取病死幼兔的鼻腔分泌物、肝脏、脾脏、肾脏等病料接种于普通营养琼脂, 37℃培养24h。

挑取单个菌落纯培养后,再将纯培养物移植到普通肉汤培养基、麦康凯培养基及血琼脂培养基上,37℃培养24h,观察培养特性。

1.8.2　细菌形态学观察　取纯培养物涂片,革兰氏染色,显微镜观察;18h的普通肉汤培养物涂片,在暗视野显微镜下观察菌体的运动情况;硝酸银染色法观察菌体周身是否具有鞭毛;用湿墨水染色法观察菌体是否具有荚膜;用Schaeffer2Fulton染色法观察菌体是否具有芽孢。

1.8.3　细菌生化试验　将分离菌纯培养物分别接种到微量生化管,37℃培养24h,观察并记录结果。

1.8.4　血清学鉴定　将分离菌的纯培养物与兔支气管败血波氏杆菌的标准阳性血清进行平板凝集试验,观察凝集现象。

1.8.5　细菌的致病性检测　将15只20日龄的仔兔随机分成3组,分别为试验组、对照组、健康组,每组5只。

试验组每只接种6×1010CFU/mL的37℃培养24h的细菌肉汤培养液012mL;对照组每只接种0.2mL的无菌肉汤培养基;健康组不接种。

1.8.6　细菌药物敏感性试验　采用药敏纸片扩散法进行,37℃培养24h,观察并记录结果。

1.9　分离菌部分分子生物学特性
1.9.1　(G+C)mol%的测定　参照文献[425]方法进行。

1.9.2　16SrRNA的PCR扩增　根据GenBank已发表的B or detell a avi um(登录号为A F177666)的16SrRNA序列,用DNAStar软件设计1对引物16SF:5′2A G A GTTTG ATCCTGGCTCA G23′;16SR: 5′2A GCAAACA GGA T TA GA TACC23′,由上海英俊生物技术有限公司合成。

对所分离细菌用华舜小量细菌总DNA抽提试剂盒抽提DNA,进行16SrRNA的PCR扩增。

16SrRNA的PCR按常规方法进行。

PCR纯化产物与pMD182T载体连接,导入感受态大肠杆菌中(T GI,E.coli T GI)[6]。

在含有氨苄青霉素(50 mg/L)的平板培养基上培养,挑取阳性克隆,提取质粒,经HindⅢ和Bam HⅠ双酶切,产物用0.8%琼脂糖电泳检测,阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序。

测序结果与GenBank上已发表的
A F177666株进行同源性比较。

1.10　病兔群血清学调查
1.10.1　平板凝集抗原的制备　将兔支气管败血波氏杆菌参考菌株接种于普通营养琼脂培养基,于37℃培养24h,用灭菌生理盐水洗下菌苔,充分混匀后,用稀释滴种法进行细菌计数,然后灭活,加结晶紫着染,反复洗涤、离心,取沉淀用生理盐水稀释至CFU为100亿/mL,加入0.1%叠氮钠防腐,经自凝性检验、无菌检验、特异性检验合格后,4℃保存备用。

1.10.2　发病兔群血清抗体的检测　利用自制兔支气管败血波氏杆菌诊断抗原分别与采集的424份发病仔兔血清进行平板凝集试验,出现肉眼可见的凝
集块者,判为阳性,否则,判为阴性。

1.11　分离菌免疫原性的检测
1.11.1　免疫原的制备　将分离菌纯培养物接种于肉汤培养基和普通琼脂培养基,37℃培养24h,通过细菌计数,将菌液浓度调整为150亿/mL,0.5%甲醛溶液灭活,然后与高压灭菌的油佐剂按1∶3的比例乳化,制备成油乳剂灭活苗[3],经常规检验合格后备用。

1.11.2　免疫原性的检测　用上述制备的油乳剂灭活苗免疫5日龄幼兔及孕前母兔。

幼兔接种20只, 0.5mL/只;孕前母兔接种5只,1.0mL/只。

对照组为5日龄幼兔10只及孕前母兔5只,均接种灭菌营养肉汤培养基,幼兔接种0.5mL/只;孕前母兔接种1.0mL/只。

幼兔免疫20d、母兔所产仔兔出生7d,分别用分离菌攻毒(6亿菌/只,腹腔接种),分别观测记录免疫幼兔和免疫母兔所产仔兔的保护率。

2　结果
2.1　细菌的分离鉴定　从10只病死幼兔的鼻腔分泌物、肝脏、脾脏、肾脏等病料中主要分离到4株细菌,其菌体形态特征、培养特性、生化特性、血清学特性和药物敏感性均一致。

分离菌为革兰氏阴性两端钝圆的小杆菌,大多分散,有的成对存在;暗视野显微镜下见菌体呈旋转运动,硝酸银染色可见菌体周围有3～5根鞭毛;用湿墨水染色未见有荚膜;用Schaeffer2Fulton染色未见有芽孢。

分离菌在肉汤培养基内生长旺盛,培养24h肉汤均匀浑浊,表面有一层菌膜;在普通琼脂平板培养基上培养48h,形成中等大、灰白色、湿润、表面光滑沿划线生长的呈菱形菌落,边缘整齐;在麦康凯培养基上培养24h,菌落不变红,形成圆形、隆起、光滑湿润的小菌落;在血液琼脂培养基上生长丰盛,形成圆形、隆起、光滑、灰色的中等大菌落,48h后颜色变深呈棕色,出现β2溶血。

分离菌生化反应结果见表1。

表1　分离菌的生化试验结果
生化试验项目结果生化试验项目结果生化试验项目结果木糖-山梨醇-V2P试验-
乳糖-甘露醇-H2O2酶+
蔗糖-棉子糖-靛基质-
葡萄糖-硫化氢-枸橼酸盐+
麦芽糖-七叶树苷-尿素酶+
侧金盏花醇-甲基红试验-阿拉伯糖-
注:“+”为阳性;“-”为阴性
分离菌均能与兔支气管败血波氏杆菌标准阳性血清反应,出现肉眼可见的凝集块。

用分离菌接种的5只20日龄的仔兔(试验组)在48h内均死亡,并从死亡的兔体中回收到了分离菌,而对照组、健康组均无异常变化,健康存活。

分离菌的药物敏感性试验结果见表2。

表2　分离菌的药敏试验结果
药敏纸片结果3药敏纸片结果3药敏纸片结果3万古霉素0氯霉素0红霉素15
链霉素8呋喃妥因0羧苄青霉素0卡那霉素14丁胺卡那14青霉素0
四环素13先锋霉素0环丙沙星24
苯唑青霉素0氨苄青霉素0丙氯派酸34
3抑菌圈直径(<)为mm
利用兔支气管败血波氏杆菌参考菌株制备得诊断抗原经质量检验,特异性强、无自凝现象。

用此抗原分别与采集的424份发病仔兔血清进行平板凝集试验,血清抗体阳性者418份,阳性率达98.58%。

根据上述分离菌的菌体特征、培养特性、生化特性、致病性及血清学特性,可以鉴定所分离的细菌为兔支气管败血波氏杆菌。

2.2　分离菌部分分子生物学特性
2.2.1　(G+C)mol%　经测定,其(G+C)mol%含量在61.7%～62.4%.结果与Kersters[5]结果相符(61.6%～62.6%)。

2.2.2　16SrRNA序列测定及同源性分析　利用设计好的引物进行PCR反应,可扩增出大小为783bp 的特异性条带(图1),与预期的片段长度相符,而对照(提取的大肠杆菌DNA)则没有特异性条带出现;重组质粒用HindⅢ和Bam HⅠ双酶切,电泳可见切出2.7kb和783bp2个片段(图2)。

根据测序结果与GenBank中收录的A F177666株波氏杆菌核苷酸序列及同时测序的本实验室保存的禽波氏杆菌和兔败血波氏杆菌S80103株的同源性分别为82.2%、99.7%(在763位发生1个核苷酸缺失)和99.8%。

2.3　分离菌免疫原性的检测　利用分离到的兔支气管败血波氏杆菌制备成的油乳剂灭活苗,经无菌检验、毒性试验、理化性状检验合格。

用此油乳剂灭活苗免疫5日龄幼兔20只,孕前母兔5只。

仔兔免疫20d、母兔所产仔兔27只出生7d,分别用分离到的兔支气管败血波氏杆菌24h培养物腹腔接种,6亿菌/只,结果免疫仔兔有4只因波氏杆菌发病,但无死亡,保护率为80%;孕兔(试验组)所产仔兔27
只,只有3只因波氏杆菌发病,保护率为88.9%。

而对照组的仔兔10只和孕前母兔所产仔兔24只攻毒后,所有幼兔均在48h 内死亡,剖检后,均回收到兔支气管败血波氏杆菌。

图1　16SrRNA PCR 扩增　M.DL2000marker ;4.分离菌;
3.S80103株;2.禽波氏杆菌;1.阴性对照(大肠杆菌
)
图2　重组质粒的酶切鉴定分析　M.DL2000marker ;3.分
离菌;2:S80103株;1.禽波氏杆菌
3　讨论
根据发病兔中分离菌的形态学特性、培养特性、生化特性、血清学反应特性等可将分离菌鉴定为兔
支气管败血波氏杆菌[7]。

在对10只具有典型症状的病死幼兔的鼻腔分泌物、肝脏、脾脏、肾脏等病料检测过程中,兔支气管败血波氏杆菌的分离率占75%,且可以造成接种幼兔的急性发病死亡。

尽管也从病料中分离到了巴氏杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌,但其分离率均低于5%。

因此,兔支气管败血波氏杆菌是本次疫情的主要致病菌。

兔支气管败血波氏杆菌(G +C )mol %、16SrRNA 测定可作为快速鉴定兔支气管败血波氏杆菌的重要手段[8]。

同源性分析结果表明,分离株
兔支气管败血波氏杆菌核苷酸测序结果与本实验室
所保存的禽波氏杆菌的核苷酸序列同源性高,表明兔支气管败血波氏杆菌与波氏杆菌属的其他波氏杆菌序列变异不明显;同时在763位发生1个核苷酸缺失,表明波氏杆菌可能由于感染宿主不同其遗传基因也存在一定的差异;而与兔支气管败血波氏杆菌参考菌株S80103株的核苷酸序列同源性高,表明兔支气管败血波氏杆菌的16SrRNA 基因保守性高;与GenBank 中收录的A F177666株禽波氏杆菌核苷酸序列之间差异明显,表明国内分离的禽波氏杆菌菌株与国外菌株在遗传基因上有明显的差异,这可能是由于与地域、气候的影响而造成基因的差异有关。

利用兔支气管败血波氏杆菌标准菌株制备的平
板凝集抗原只与兔支气管败血波氏杆菌阳性血清出
现肉眼可见的凝集块,而与大肠杆菌的阳性血清、鸡白痢沙门氏菌阳性血清、新城疫阳性血清及禽流感阳性血清等没有出现凝集现象,说明该抗原特异性强,并无自凝现象,符合诊断抗原的质量标准,因此该诊断抗原适用于生产实际。

该抗原在用于检测发病兔群兔只血清抗体的过程中,具有极强的特异性,而且方法简单、便于操作,因此可以在生产中推广应用。

通过对分离的兔支气管败血波氏杆菌的免疫原性的检测表明,该菌对仔兔的主动免疫保护率为80%,而通过免疫孕兔,借助母源抗体建立起的被动免疫对仔兔的保护率可达88.9%,由此可见被动免疫效果略好于主动免疫效果。

另据资料报道,兔支气管败血波氏杆菌主要感染幼兔,随着家兔日龄的增长,对波氏杆菌的抵抗力逐渐增强[9]。

由于幼兔的免疫系统尚不健全,因此如果采取免疫预防兔波氏杆菌病,我们建议最好通过免疫孕前母兔的途径,使仔兔借助母源抗体而获得早期抗感染的作用。

由于兔支气管败血波氏杆菌是一种环境致病菌,在全国兔场中普通存在,所以控制该病要采取综合措施,平时要注意加强饲养管理,搞好环境卫生,采取灭活疫苗预防注射,发病时及时作出正确诊断,使用敏感药物及时治疗。

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