消化酶特性 使用 选择 象征性地1分

消化酶特性与陪法，用法
一、常见的胶原酶
胶原酶Ia型400-600U/mL 膀胱恶性肿瘤
胶原酶Ib型200U/mL 脑肿瘤
胶原酶I型1U/mL
胶原酶Ｉ型675U/mL 前列腺
胶原酶I V型1g/L 正常或恶性胃上皮
中性蛋白酶300U/mL 结肠肿瘤
中心蛋白酶100U/mL 肌上皮
胶原酶1g/L 肺肿瘤
粗制胶原酶200U/mL 一般组织
二、热trpsin-DNaseI消化细胞步骤：
1试剂：
25g/L（将100ml储存液溶化后，每10ml分装于灭菌的通用容器中，并储存于-20℃）
4g/L DNA酶（使用D-Hanks配制4g/L的DNaseI酶母液，0.22um滤菌。

1mL/管，1.5ml管粉状，-20℃
70%甲醇/30%水，体积分数含10% D-Hanks终止反应液
2步骤：
1）溶解10mL 25g/L trpsin，加90mL D-Hanks，配制成0.25%的工作浓度，小心摇匀。

2）溶解1mL DNA酶，加入100mL 0.25% trpsin中，使其浓度为0.4%。

3）使用10mL D-Hanks冲洗剪碎的组织片3次至少，以除去血清中trpsin的抑制剂，弃去洗液。

4）将组织小块从培养皿中转移至放有无菌磁力搅拌子的锥形瓶中（使用无菌的刮勺或茶勺转移。

使用广口瓶，使组织块易于防止与瓶底，避免组织贴于瓶壁造成损失。

）
5）每1倍体积的组织块加入约10倍体积的0.25% trysin-0.4% DNaseI(37℃预热)（注：如果组织一般为2cm3，则100mL消化液足够3-4份样品的消化）。

6）锥形瓶口使用铝箔片重新封口，至于搅拌器上，设置合适的搅拌速度，使组织块悬浮；搅拌时应只有较小的漩涡，没有泡沫。

7）trpsin消化20-30min。

8）停止搅拌，使较大的未消化的组织块沉淀。

小心去除铝箔盖，将含有细胞的酶溶液倒入通用容器。

倾斜锥形瓶使组织块沉淀，使用长巴斯德吸管或10吸管吸出细胞悬液。

9）加等体积的含血清培养基终止消化（容器可用50mL离心管，代替普通试管）。

10）将含有释放细胞的离心管1000rpm 5min沉淀细胞，培养基重悬浮细胞，标记为T1,4℃储存。

11）在锥形瓶中加入新鲜的、预热的0.25% trysin-0.4% DNaseI，重复两次5）-10）(消化时间可以短些)，收集后标记为T2，T3。

（当仅剩白绒毛状的结缔组织块时，即消化完全）。

12）进行细胞计数和细胞活力测定。

确定每次收获的细胞活力，合并产量大、活力高的细胞。