13第13章免疫组织化学技术

设立对照的目的在于证明
四、结 果和肯判定阳断性结果的特异性， 采用主已要知针抗对原第阳一性抗标体本。与 待检标本同时进行
➢对照实阳阴验性性：对对必照照须先离性阳设用前抗性用心标性立与血体抗抗已接后本反待清已原对体用以生知法再应应测或确所反照缓排物过和进呈是抗非认致应以冲除素量间行阴与原免阳非，排液组或法抗接组性天同疫性 特间除代织内常原法化，然一血反异接假替细源采与均染其抗种清应性法阳第胞性用第可色目原动代不反常性一内酶。一采，的相物替是应采抗所。抗用此在同免第异。用体含直体时于的疫一嗜直。，的接反的确抗应阳认原，
五、质 量 控 制
包括第一抗体和
试剂的质量控第二制抗体
预试验
➢ 抗体特异性、敏感性测试 ➢ 抗体最佳稀释度的选择 ➢ 稀释剂 ➢ 抗体孵育温度、时间
质量
操作过程质量控制
操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作 人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好
标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型 质控品，可用于监控标本制备、操作过程、 染色步骤、试剂质量等问题引起的误差
➢ 标记方法：搅拌法、透析法 ➢ 标记抗体的纯化：游离荧光素、未标记或过度标记
蛋白的去除 ➢ 标记抗体的质量鉴定：抗体特异性、效价、荧光素
与蛋白质结合比率F/P
荧光免疫组化染色
直接法：
优点：操作简便、特异性高
标记抗体
缺点：敏感度偏低、抗体
抗原
标本
制备麻烦
载玻片
间接法： 优点：较直接法灵敏，标记一种抗
仪器的质量控制
相关技术设备、仪器和器具定期校对、对试管、 吸管、移液器等消毒。
第二节 免疫荧光组织化学技术
定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探
针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗 体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在 荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置 及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。 以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测 定的目的。
体可以鉴定多种抗原 缺点：非特异荧光、操作时间较长
补体法： 优点：敏感度较高、标
记一种抗体可以鉴定 多种 抗原、适用于任 何动物的抗原抗体系 统 缺点：非特异荧光、需 新鲜补体、操作麻烦
抗体 抗原 标本
标记抗补体抗体 固定补体
载玻片
双标记荧光免疫染色法： 用两种荧光素分别标记 不同抗体，对同一标本 中的相应两种抗原同时 显示
➢确证实验：
空白实验
替代试验
吸收或阻断试验
阳性细胞显色分布类型 细胞质 细胞核 细胞膜表面
阳性细胞显色：抗原分布于细胞核
阳性显色深浅反映抗原存 在的数量，可以作为 定性的依据 定位的依据 定量的依据
阳性细胞呈散在分布
阳性细胞分布分为 散在分布 灶性分布 弥散分布
阳性细胞呈灶性分布
阴性结果和抗原不表达
抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原 与抗体的识别与结合 ➢ 固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质 及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂
微蛋生白物质抗抗原原——丙乙酮醇或或三甲氯醇化碳
组织切片技术
首选，适用于 不稳定的抗原
冰冻切片：较好地保存组织抗原的免疫活性
石蜡切片：形态保存好，可以用于回顾性研究
煮沸恢复抗原法
三、抗 体 的 处 理 与 保 存
抗体的选择
➢注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体 ➢多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低 ➢单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低
抗体的稀释
➢ 抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果 ➢ 使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度
抗体的保存
➢ 分装密封保存，避免对抗体的污染 ➢ 并注明标记（批号、名称、效价、量） ➢ 根据厂家提供的保存条件保存 ➢ 避免反复冻融而使抗体效价降低
13第13章免疫组织化学技术
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一、标 本 的 处 理
标本的类型 组织片标本：活组织检查标本，手术切除标本 细胞片标本：组织印片、铺片、培养的粘附细
胞、体液 、 穿刺液的细胞悬液涂片
标本的固定
➢ 良好的固定是免疫组织化学结果可靠的重要保证 ➢ 固定的原则：不损伤组织细胞的固有形态、结构、
使遮蔽的组织抗原决定应簇胰及重蛋高新温白速暴度酶分露、—子的时中运方间度动法、消能，以化量即最酶解抗大开原
修复。 ➢ 常用的方法有：
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酶消化法
盐酸水解暴露抗原法 也是利用热效 微波炉恢复抗原法 应恢复抗原性 高压锅恢复抗原法
标记抗体B
抗原B 标本
标记抗体A 抗原A
表面）
挤压的细胞区域
由于细胞内抗原含量不同，所 不限于单个细胞，而是累及一
以显色不均一
片细胞，均匀显色
阳性与阴性细胞相互交杂，同 细胞和周围的结缔组织均无区
一切片上显色强度不一
别的着色
免疫组化结果与HE染色结果
当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时, 应再结合临床资料，如性别、年龄、部位、X线 等影像学及实验室结果综合分析, 不能简单地推 翻HE切片诊断。（HE，苏木精-伊红染色）
➢ 阴性结果:不能简单认为具有否定意义， 阳性表达有强弱、多少之分，
➢ 只有少数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也要 视为阳性表达,
➢ 不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。
特异性染色与非特异性染色
特异性染色
非特异性染色
分布在特定的部位, 具结构性 无分布规律，常出现在切片边
（如细胞质、细胞核、或细胞 缘、刀痕或皱折部位及坏死或
是观察组织细胞结构的理 想方法，有连续性。但抗 原保存不如冰冻切片。
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白
交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使
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一、组 织 的 处 理
➢ 标本的类型：
涂片和印片 组织切片
铺片
培养的粘附细胞
悬浮细胞 活细胞
➢ 标本的保存 ： 标本固定干燥后，最好立即检测 保持干燥、置4℃甚至-20℃ 以下保存
二、荧光抗体的标记及染色
➢ 常用的荧光素： FITC黄绿色；RB200、TRITC橙红色；PE红色；AMC 蓝色；Cy3橙红色；Cy5红色；德克萨斯红橙红色