免疫组化原理及流程介绍

常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修 复。
酶消化方法一般用于细 胞内抗原
应用高频电磁波打开蛋白质间的 交联键
免疫组化原理及流程介绍 具体操作（微波修复）：
1) 将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约4次，每次间隔补足液体，防止 干片。
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二 免疫组化的原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原 抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
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它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显 微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病 原体以及受体等)。
阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片
呈阳性结果，标为阳性对照。
阴性对照：
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对 照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。
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免疫组化染色实验组与对照组结果分析表
中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于 分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。
（2）所有切片呈阳性反应，其原因：
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①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。
③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。
④抗体温育的时间过长。
⑤H2O2 浓度过高，呈色速度过快且粘 附剂太厚。
免疫组化原理及流程介绍 （3）所有切片背景过深
① 内源性过氧化酶没有完全阻断 ② 切片或涂片过厚 ③ 漂洗不够 ④ 底物呈色反应过久
⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血 ⑥ 使用全血清抗体稀释不够
（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
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最常见的原因是： 标本的固定和处理不当
注意事项：
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• 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。
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• 主要内容 一.免疫组化的发展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的基本流程 四.免疫组化的结果分析
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一.发展简史
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1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP） 技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
情
况
(3)所有切片背景过深
(4)阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应
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免疫组化原理及流程介绍 (1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活
3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
阳性对 阴性对 替代对 实验 组
照
照
照
1
－
－
－
－
结论 操作错误
2
＋
＋
＋
＋
非特异性反应
3
＋
＋
－
－
阴性对照含定位Ag
4
－
－
－
＋
阴性对照不含定位Ag
5
＋
－
＋
＋
受检组织非特异性染色
6
＋
－
－
－
受检组织不含定位Ag
7
＋
－
－
＋
受检组织含定位Ag
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阳性对照 阴性对照 替代对照 实验 组

结论
6
＋
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具体操作：
1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min
7.SP反应
SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO 基。
度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。
1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。
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具体做法：
甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、 1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
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• 4.一抗的清洗：
（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 （2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式； （3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
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• 5.PBS的PH和离子强度的使用。
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建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
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3. 抗原修复 暴露抗原决定簇
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及 醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重 新暴露，提高抗原检测率。
抗原修复的主要方法:
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80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、 功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命 科学工作者应该掌握的基本技术之一。
4) 80% ethanol 2 minutes；
5) 70% ethanol 2 minutes；
6) distilled water:5 min；
7) PBS 洗 3 ×3 min。
具
体
操
作
2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
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(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等 通透液。
SP染色法的特点: 灵敏特异性低，成本低。
具体操作： 1） 加入 SP 复合液后放入 37 度烤箱中 30 min。
2） 用 PBS 洗 5 次×5 min。
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8.显色
在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借 助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
免疫组化原理及流程介绍 4.封闭特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。
封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织 中有交叉反应的位点发生结合。
免疫组化原理及流程介绍 具体操作：
将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗 来源一致）后放入湿盒中,室温 (约30℃)下10～30min。
通常在过氧化物酶（HRP）法中，显色剂为DAB。
DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)
配法:DAB
50mg
0.05M TB 100ml
30%H2O2 30-40ul
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ABC 法 SP法 PAP法
免疫组化原理及流程介绍 9、复染、脱水、透明、封片
复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。
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(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABC法和SP法中， 免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进 行灭活。
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具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％ H2O2。
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6.二抗孵育
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光 或显色基团），作用是检测一抗。
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•
二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。
•
但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
• 3) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min • 4) 封片：中性树胶。
四 免疫组化结果分析
免疫组化结果的判断原则：
1.必须设对照。 2.抗原表达必须在特定部位。 3.阴性结果不能视为抗原不表达。
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实验分析的相关介绍
－
－
－
受检组织不含定位Ag
7
＋
－
－
＋
受检组织含定位Ag
• 从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。1～5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC 技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用 Ab.
★除上述对照结果分析之外，还必须从以下几个方面综合评价：
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1．阳性染色特点 ① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色 细胞与组织无 区别） ② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）。
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。 若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
1) 60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes；
2) 100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes；
3) 95% ethanol 2 minutes；
三 免疫组化的基本流程
1.脱蜡与水化 22.细.细胞胞通通透透、、封封闭闭内内源源 性性过过氧氧化化物物酶酶
3.抗原修复、暴露抗原 决定簇
4.封闭非特异性蛋白
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5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应 8.显色 9.复染、脱水、透 明、封片
1.脱蜡与水化
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大一点
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5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否 用肉眼是看不出来的。
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•
一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。
•
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓
• 2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止 干片 。
• 3.以下原因可能导致片子着色不均匀： • ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立即放入新鲜的 二甲苯中； • ② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； • ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； • ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； • ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 • ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。
片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗， 在放入氨水中返蓝即可。
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• 1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或 胞膜蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。
• 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （12） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。
2．组织切片制作过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。
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3．人工假象与特异性结果显示不在同一 平面上。
▲染色失败的几种原因：
染 色 失
(1)所染的全部切片均为阴性结 果，包括阳性对照在内。
败
的
可
能
(2)所有切片均呈阳性反应