免疫组化原理及应用

象PAP法那样由抗酶血清制备而成，所以背景着色减少，
敏感性更高。
HRP HRP
ABC法：
HRP biotin
ABC复合物 马抗兔（二抗）
兔抗x（一抗）
⑥S-P法：是在ABC法的基础上进行了改进，第一、第二步
与ABC法相同，在第三步，将链酶卵白素直接与酶耦合在
一起，减少了操作步骤，进一步增加了灵敏度，现被广泛
应用。
HRP
HRP
S-P法：
SA
酶链卵白素
HRP
BT
羊抗鼠IgG（二抗）
BT 鼠抗x（一抗）
（三）具体操作步骤
以S-P法为例：
1. 石蜡切片脱蜡至水；
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可 在此步后进行）；
3. 3活%性H；2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的
4. 5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。 倾去血清勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液， 37℃孵育1-2小时或 4 ℃过夜；
HRP HRP
PAP法：
HRP
兔PAP复合物（三抗）
羊抗兔IgG （二抗）
兔抗 x
（一抗）
⑤ABC法：很早以前，人们就注意到给动物饲以大量的鸡蛋
白，会引起明显的“维生素H缺乏症”。经研究发现，在
鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子量为68000，称卵白素
（avidin）。一个avidin分子上有4个biotin（生物素）结合
—HRP(FITC)
直接法：
②间接法：也称二步法。第一步用的是不标记的第一抗体， 第二步用标记有酶或荧光素的抗第一抗体同种动物IgG的 抗体。本方法的优点是在检测各种不同抗原时，只要第一 抗体是免疫同一类动物产物的抗体，均可应用相同的第二 抗体，不象直接法那样需对各种抗体逐个标记。此外由于 第一抗体的一个分子作为抗原可结合多个第二抗体分子， 故敏感性较直接法大为提高。
7.检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶 的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的 颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底 物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考 虑上述因素外，还应考虑：
1.标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会 影响到所检测的抗原的数量和质量；
9. PBS冲洗，5分钟×3次；
10. 显色剂显色（DAB或AEC）；
11. 自来水充分冲洗，复染，封片。
（四）免疫组化常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原 因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
1. 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三 抗及底物等；
5. PBS冲洗，5分钟×3次；
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀 释），37 ℃孵育10-30分钟；或滴加第二代生物素标记二 抗工作液，37 ℃或室温孵育10分钟；
7. PBS冲洗， 5分钟×3次；
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链酶卵白素（PBS稀释）， 37℃孵育10-30分钟；或第二代辣根酶标记链酶卵白素工 作液，37 ℃或室温孵育10-30分钟；
的酶结合，制备成非常稳定的环形复合物，此环形复合物 由三个酶分子及二个抗酶抗体分子组成。故PAP法染片时 所用抗体依次为：特异性第一抗体；第二抗体，也称桥抗 体，它是兼抗第一及第三抗体动物IgG的抗抗体；第二抗 体要相对过剩，除了和第一抗体结合外其另一Fab端可游 离出来，与后面的第三抗体（即PAP复合物）相结合。 PAP法由于层层放大，一个分子的组织抗原最后可结合多 个酶分子，因此特别敏感。
HRP— 酶桥法：
—HRP
三抗（抗酶抗体）、兔抗HRP 二抗（桥抗体）、羊抗兔IgG
一抗（兔抗x)
④PAP法：此法由酶桥法发展而来，关键的试剂是PAP复合 物（第三抗体）。主要步骤是将辣根过氧化物酶作为抗原
免疫动物，产生抗酶抗体，所用动物的种类应和制备第一
抗体者相同，抗酶抗体在应用到组织切片以前，先和足量
2. 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够 的时间；
3. 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的 检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如， 如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹 配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠 的IgM（不是IgG）二抗；
位点，二者间的亲和力比抗原-抗体的亲和力要大100万倍。
利用这一特性，1981年美籍华人许世明发明了ABC法。
ABC法的步骤依次为：第一抗体；结合有biotin的第二抗
体；以及ABC复合物。ABC复合物是由1分子avibin和3分
子结合有过氧化物酶的biotin所组成，最后进化学的亲和结合，不
﹣ ：无阳性细胞 ﹢ ：一般阳性细胞数比例为1---25% ++ ：一般阳性细胞数比例为26---50% +++：一般阳性细胞数比例为>50%
2 阳性细胞数加着色强度判定法：既同时考虑了阳 性细胞数又兼顾了着色强度，是目前较为广泛的 应用方法。
① 阳性细胞数量计0---4分：无阳性细胞计0分， ≤25%计1分，26---50%计2分，51---75%计3分， >75%计4分。 ② 染色强度计0---3分：无色计0分，浅黄色计1 分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。
然后将两项指标评分相乘，根据总分分为四级： 即0分为阴性（-），1—2分为弱阳性（+），3--4分为中度阳性(++)，大于4分则为强阳性(+++)。
(如EMA、EGF-R、CD30）或细胞浆和细胞 核同 时表达：如c-myc;
（六）免疫组化阳性强度判断标准：
目前还没有完全统一的判断标准，一般公认 的有两种方法：
1 单独计算阳性细胞数占所计细胞数的百分比。一
般计数500---1000个细胞数中阳性表达细胞的个 数，然后换算成百分率。用﹣、﹢、++、+++分 别来表示阴性、弱表达、中度表达、强表达。
3. 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗体不纯、标本片中 含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染 色只能通过采用高纯度、高效价的抗体或针对更具特异性 抗原决定簇的单克隆抗体来解决；
4. 一抗的使用浓度是否过高；
5. 清洗是否充分。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利 于减低背景着色；
6. DAB的使用是否正确。 DAB的孵育时间和配制方 式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒 时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意 校正蒸馏水的pH值，以确保试验结果的正确性； 粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒 须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生 斑点状着色。另外， DAB保存不妥产生氧化物亦 可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处， 现用现配，临用前加 。孵育时间过长也会造成背
(二)方法：有直接法、间接法、酶桥法、PAP法、ABC法及 S-P法等。目前最常用的是S-P法和ABC法。
①直接法：应用最早，人们最初将酶标记在特异性抗体上， 直接去检测组织细胞中的抗原。但是这种方法的弊端是显 而易见的，除了放大作用非常有限外，制作成本也很大， 因为每检测一种抗原，都需标记其相应的抗体，所以这种 方法很快被间接法所取代。
2.不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定 剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种 同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照 生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定；
3.抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。一 般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由 于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所 以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出 最佳的使用浓度；
免疫组织化学法
(一)原理：免疫组织化学(IHC)是利用抗原抗体的特异性结合 反应，用已知抗体去检测和定位组织或细胞中相应抗原存 在的一种方法。免疫组织化学技术不仅有较高的敏感性和 特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起 来，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上定位一 些蛋白质或多肽物质的存在。无论是癌基因或抑癌基因， 其蛋白产物的过度表达都可以利用相应的抗体，应用免疫 组化方法进行检测。随着生物学研究的进展，发现越来越 多的蛋白质，包括各种癌基因和抑癌基因产物、细胞因子、 受体及生长因子等在细胞调控中担负着重要功能，不少蛋 白质已被纯化，大量的单、多克隆抗体被制备，目前几乎 所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有其相应的抗体问世， 其中大多数抗体及试剂盒已商品化，为癌基因和抑癌基因 的研究提供了十分有利的条件。
间接法：
—HRP(FITC)
③酶桥法：先用特异性抗体（一抗）与组织中抗原结合，接 着用桥抗体（二抗）结合一抗，再将抗酶抗体（三抗）结 合于桥抗体上，最后把酶结合在抗酶抗体上，经过底物显 色反应显示抗原。桥抗体必须是对一抗和抗酶抗体都具有 特异性才能将二者相连，所以一抗和抗酶抗体（三抗）必 须由同一种属动物制备。酶桥法的敏感性较间接法又有所 提高。
景染色；
7. 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘 部的非特异性染色。
（五）免疫组化阳性表达模式
1 细胞膜表达：大多数淋巴细胞抗原表达如此， 如CD20、CD45RO；
2 细胞浆表达：如细胞角蛋白（cytokeratin CK）、波形蛋白（Vimentin）等；
3 细胞核表达：ER、PR、Ki-67、P53等； 4 混合性表达：出现细胞膜和细胞浆同时表达,
4.切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人 为地对抗体进行了进一步的稀释；
5.孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
非特异性染色
1. 是否有效地除去了内源性酶和生物素；
2. 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特 异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用 PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时 其它无关蛋白，如牛血清蛋白也常应用。另外，取材时避 开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5% 脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错；
4. 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液；
5. 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素 的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4-8℃条件下 保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性 有机溶剂同放一处，以免降低抗体的效价；
6.检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性 对照；