RNA干扰分析

2018/10/21
• 为了应对外源遗传物质的侵入，很多物种发展出具有很 高特异性防御措施来“消灭”外界入侵的核酸，以阻止 它们整合到宿主的基因组或干扰正常的细胞活动，这种 核酸诱导的免疫过程的核心就是双链RNA（doublestranded RNA, dsRNA）。 • 双链RNA的作用机制在于它能够触发不同类型的基因 表达的抑制，即基因沉默，统称为RNA沉默（RNA silencing）。RNA沉默是从酵母到人类都保守的一种 基因沉默机制。
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2018/10/21
1. siRNA设计的原则
① 在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列，起始是AA ② 一般在靶mRNA起始密码下游100—200bp至翻译终止密 码上游100bp的范围内，其中AA（N19）TT是最理想的 序列，若靶mRNA中无此序列，亦可选用NA（N21）或 NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶）； ③ 在19nt的RNA片断中不能含有连续4个T或A的区域； ④ 通过BLAST 确定片断的特异性； ⑤ 通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最 有效的siRNA序列。
·1960年 出生于美国
·1990年获得哈佛大学生物 学博士学位 ·现任美国哈佛大学马萨诸 塞州医学院分子医学教授
2018/10/21
2018/10/21
RNAi在哺乳动物细胞中应用的
具体设计策略 一．靶siRNA序列的选择 二．siRNA的五种制备方法 三．siRNA的转染 四．实验对照的设置 五．干扰效果的检测 六．RNAi的应用前景
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2006年诺贝尔生理/医学奖获奖者简介
安德鲁· 法尔(Andrew Fire)
·1959年出生于美国加利福尼亚州圣克 拉拉县 ·1983年获美国麻省理工学院生物学博 士学位 ·现任斯坦福大学斯坦福医学院病理学 和遗传学教授
2018/10/21
克雷格•梅洛（Craig C. Mello ）
RNA沉默
----真核细胞基因表达调控的新途径
• 近年来，人们逐渐认识到，基因的沉默（gene silencing） 相对于基因的激活（gene activation）而言，也是一种 重要的基因表达调控手段。 • 基因如何激活目前已经研究得比较透彻，但相对而言， 人们对基因如何失活、被抑制了解得并不多。 • 随着这几年RNA干扰（RNA interference, RNAi）和 microRNA (miRNA)领域的研究，一种古老、有效的抑 制基因表达的机制又一次向我们展示出生命世界的丰富 多彩。
2018/10/21
siRNA的特点
1. 长度约在22nt左右。 2. 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具 有Dicer产物的特点。 3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。 4. 是RISC组分。 5. siRNA合成是由双链的RNA形成的。 6. siRNA一般是人工体外合成的，通过转染进入 人体内，是RNA干涉的中间产物；
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siRNA的特点
7. 结构上， siRNA是双链RNA。 8. 在Dicer酶的加工过程中， siRNA对称地来源 于双链RNA的前体的两侧臂。 9. 在作用位置上， siRNA可作用于mRNA的任 何部位，并与mRNA完全互补。 10. 在作用方式上， siRNA只能导致靶标基因的 降解，即为转录水平后调控。 11. siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原 始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
微量双链RNA所引起的。
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RNAi的发现
• 实验： 将纯化后的单链反义RNA注射线虫，结果只有微 弱的基因抑制作用。 用纯化的双链RNA（反义RNA和正义RNA）注射 线虫，却能高效特异性阻断相应基因的表达，抑制效 率比单独注射反义RNA诱导基因沉默的效率高2个数量 级。 • 由此推断，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大 降低了靶mRNA水平(Fire等，1998)。 • 人们将这一现象命名为RNA干扰，RNAi （Arenz & Schepers，2003)。
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RNAi的发现
1998年，匹兹堡大学的Richard Carthew等人证明RNA干 扰现象在果蝇（Drosophila melanogaster）中也存在。 随后的一年时间里，又陆续发现RNA干扰现象也存在于 真菌、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所 有真核生物中。 这说明RNA干扰现象很可能是在真核生物进化的很早期 阶段就已经产生了。
2018/10/21
2006年诺贝尔生理/医学奖
• 目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域， 成为了一种主要的生物学研究工具，发展得相当迅速， 并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐，获得2006 年诺贝尔奖医学/生理奖。
颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的 基本机制， 解释了困惑这一研究者们许久的难题。” “像在 清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。
2018/10/21
RNAi的发现
• 2000年2月，剑桥大学的研究人员发现，在哺乳动物小 鼠的早期胚胎中，也有RNA干扰现象。表明RNA干扰 也存在于哺乳动物中，同时利用RNA干扰研究人类基 因功能和治疗人类疾病提供了希望。 • 2000年6月，密歇根大学的研究人员又发现RNA干扰在 体外培养的细胞系中也能实现，从而使利用RNA干扰 技术研究细胞复杂的信号转导途径的生化和分子机制 更为便捷。
2018/10/21
一. 靶siRNA序列选择
靶siRNA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳 动物细胞RNAi实验中，使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成，两条链3’端均 有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，其中正义链的前 19nt与靶基因序列相同。
http://www.genesil.com/business/products/order2.htm http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
2018/10/21
siRNA设计
1） 物种特异性：一般来说，siRNA都具有物种特异性，很少与其他 物种有相同的靶位点，所以针对人基因设计的siRNA不会沉默其他 物种的同源序列。然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能 对两个或两个以上的物种有效（人、小鼠、大鼠可能能找到共同 靶点，但有效性需进一步鉴定），这需要仔细进行siRNA设计和生 物信息学分析。 2） 靶标一般在CDS区选择：siRNA的作用是在mRNA水平，而不 是在蛋白质水平。要设计siRNA，需要准确知道靶mRNA序列。由于 遗传密码的兼并性和密码子的偏移，不可能通过蛋白序列准确预 测核苷酸序列。转录后的RNA前体通过剪接去除内含子序列形成成 熟的mRNA。因为siRNA的功能是酶解mRNA序列的，根据基因组序列 设计的RNA序列有可能落在内含子区，导致设计的siRNA无效，所 以应该根据mRNA序列而不是基因组序列来设计siRNA。
2018/10/21
RNAi的发现
• 直到1998年，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马 萨诸塞大学医学院的Craig Mello才解开这个谜底。他 们通过大量的尝试发现，Guo发现的正义RNA对基因 的表达抑制，以及过去利用反义RNA技术对基因表达 的阻断，都是由体外转录制备的单链RNA中污染的
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Fra Baidu bibliotek
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51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGAGCCTCCG 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG 201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC 301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGCC 351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC 601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA 801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG 851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG 901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT
2018/10/21
RNAi的发现
• 1995年，康奈尔大学的S. Guo博士和Kemphues在线虫 （C.elegans）中进行反义RNA实验时，意外的发现， 对照实验中给线虫注射正义RNA，不但不增加该基因 的表达，反而如反义RNA一样，也能特异性的阻断该 基因的表达。 • 这与反义RNA技术的传统解释机制完全相违背，在当 时一直无法解释这一现象。正义RNA (sence RNA) 也 具有很高的基因沉默活性。
2018/10/21
转录后水平的基因沉默现象---RNA干扰
• RNA干扰现象的发现、作用机制及应用研究在 2001~2003年连续三年被Science杂志评为当年十大科学 突破，其中2002年位于十大之首； • 2003年美国Fortune（财富）杂志将RNA干扰与基因重 组技术、单克隆抗体技术并称为生物制药业三大“金 矿”。 • 那么，这座“沉默”的“金矿”是如何被发掘出来的 呢？
2018/10/21
2. 高效siRNA的序列结构特征
① G/C含量低(30%-52%)； ② 正义链3’端具较低稳定性（有利于siRNA与RISC的结合和解链）； ③ 无反向重复序列（有利于减小siRNA的有效作用浓度，提高 siRNA干扰效率）； ④ 正义链碱基的偏爱性A19（正义链中第19位碱基为A，如下表示 类同）； ⑤ A3； ⑥ U10； ⑦ 无G/C19(正义链中第19位碱基不为G或C)； ⑧ 无G13。