发酵过程多尺度优化案例分析(郭美锦)

毕赤酵母表达系统特点：
真核系统 受甲醇严格调控的强启动子（PAOX1，PGAP，PFLD 等） 成熟的高密度培养技术 高外源蛋白表达量（无论是胞内还是胞外表达） 外源蛋白基因遗传高稳定性
重组蛋白表达策略
高拷贝数 高密度 高表达 防蛋白降解 分泌效率 翻译效率 转录水平
Typical profiles of Pichia pastoris with MutS type
生 理 参 数
案例分析:多拷贝毕赤酵母发酵
• 毕赤酵母（Pichia pastoris） • 猪胰岛素前体(Porcine insulin precursor,PIP)
毕赤酵母研究背景
毕赤酵母简介： 经过二十多年的发展，毕赤酵母表达系统已发
展成为外源蛋白表达最常用的表达系统之一，已
有超过五百种蛋白在该系统中成功表达。
2.50
relative ratio
2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 1.00 1.08
H2O2，ROOH，·OH
0G0
6 G6
18 A3
GLR1 TRR1
高拷贝菌株可能受到氧化胁迫
胞内ROS和GSH水平
PIP
活性氧（ROS） 水平
GSH
ROS
aox 甲醇代谢途径关键酶基因的转录差异分析
AOX1 0.35
FLD 1.80
PIP
PDI1
2.74
KAR2
3.14
ZWF1
6.78
DAK GAP 0.79 CIT1 PDH
0.73
PYK2
1.68
GLR1 TRR1
0.34
GSH
ROS
1.75
氧化胁迫
拷贝数对毕赤酵母生理代 谢影响的转录差异分析
高拷贝菌株中，甲醇代谢途径的变化，使得由于细胞合成的碳 源和能源供应不足，因此细胞生长缓慢；同时也表明PIP蛋白的翻 译可能是蛋白表达的限制性因素 为什么高拷贝菌株中甲醇代谢途径发生变化？ 拷贝数增加 蛋白合成量增加 蛋白氧化折
CIT1 PDH
PYK2
relative ratio
GAP
0.00
1.00 0.50 0.00
G0
G6
A3
低拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比）
AOX1
FLD
PIP
PDI1 KAR2
1.43
ZWF1
3.14
DAK
GAP CIT1 PDH GLR1 TRR1
PYK2
GSH
ROS
高拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比） 甲醇代谢显著变化
OUR(mmol.L-1.h-1)
诱导 补料
30 40 50 60 70 80
CER OUR RQ 90
-0.6 -0.8
140 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20
诱导 补料
30 40 50 60 70 80 90
-0.8 -1.0 100 110
-1.0 100 110
fermentation time (h)
OD600
1-copy 6-copy 12-copy 18-copy
PIP(mg/L)
700 600 500 400 300 200 100 0
1-copy 6-copy 12-copy 18-copy
200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
relative ratio
1.00 1.00 0.50 0.00 0.35 1.00
1.50
AOX1 FLD1
2.00
relative ratio
0 G0
1.80
G6
6
PIP
18 A3
fld
1.00 1.03
1.50 1.00 0.50 0.00
DAK
1.50
0 G0
G6
6
18 A3
dak
1.00 1.10 1.13
2.4倍、5.1倍
呈下降趋势（RQ：0.75）
呈上升趋势（RQ：0.75+0.5）
6.1倍、2.5倍
甲醇浓度与、蛋白表达的关系
1.2 1
0.8
•PAOX1强度与甲醇浓度关系： <0.75g/L •PAOX1启动与表达关系：
乙醇氧化酶 甲醛脱氢酶 植酸酶活性 植酸酶表达速率 甲醇浓度 甲醇消耗速率
0 2 4 t/h 6 8 10
物理参数
温度 压力 搅拌 功率输入 通气流量 泡沫水平 加料速率 基质 前体 诱导物 培养液重量 培养液体积 生物热 培养液表观 粘度
直接参数
成熟
化学参数
不成熟
成分浓度 糖 氮 前体 诱导物 产物 中间代谢物 金属离子 脱氢酶活力 各种酶活力 细胞内成分 蛋白质 DNA RNA
积累消耗量 基质 酸 碱 消泡剂 细胞量 气泡含量 气泡表面积 表面张力
200 180 160
(mmol.L -1.h -1)
fermentation time (h)
1.2 200 180 160
OUR, CER (mmol.L -1 .h-1 )
1.2 18-copy CER OUR RQ 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
12-copy
CER OUR RQ
3.00 2.00 1.00 0.00
3.14
relative ratio
PIP
PDI1 KAR2
0 G0
6 G6
18 A3
8.00 8.00
kar2kar2
6.78 6.78
relative ratio
4.00 4.00 2.00 2.00 1.00 1.00 0.00 0.00 G0
relative ratio
胞内表达
分泌表达
拷贝数对外源蛋白表达的影响——负 效应
30+
30+
拷贝数
Hohenblum, H. et al（2004） Cos, O. et al（2005）
Inan, M. et al（2006）
基因水平
外源基因拷贝数
反应器水平
外源蛋白产量
细胞水平
毕赤酵母生理
甲醇利用降低、生长缓慢 死亡率升高
0.6
0.4
启动应有一定强度（过 渡阶段）表达速率才能提高 •过高甲醇浓度的影响：
0.2
0
过高引起表达速率下降， 同时加强甲醇完全氧化途径， 浪费能量
多拷贝基因菌株发酵过程特点
图 生长阶段与表达阶段的耗氧比较
低拷贝基因菌株与高拷贝基因菌株发酵比较
高拷贝菌株PIP2.0-1发酵过程图
低拷贝菌株YP99的发酵过程图
PART 1:r-Phytase
工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （4）：启动时间与强度
PART 1:r-Phytase
PAOX Activation
Start induction OUR/CER increase here
诱导阶段主要代谢途径关键酶酶学过程在线参数综合分析
糖酵解途径中关键酶丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）的活性 三羧酸循环中的关键酶异柠檬酸脱氢酶（IDE）活性 HMP途径中的关键酶6-P-葡萄糖脱氢酶(G-6-P)活性 甲醇完全氧化代谢的甲醛脱氢酶(FAD)、AOX的活性
发酵过程多尺度优化案例
郭美锦 华东理工大学 中国 上海
青霉素发酵曲线
基因工程菌红霉素发酵曲线
303-09-433批基因工程菌代谢过程曲线(接种量10.7%) 发酵中期（70-90h）随着补糖速率的快速上升，RQ上升 ，OUR、CER出现第二高峰，即“二次生长”。
阿维菌素发酵过程曲线
背景
发酵过程优化与放大是 一个令人困惑的问题？
30
诱导
40 50 60 70 80 90
-0.8 -1.0 100 110
诱导 补料
30 40 50 60 70 80 90
-0.8 -1.0 100 110
1-copy 6-copy 12-copy 18-copy
fermentation time (h)
fermentation time (h)
重组蛋白表达策略
高拷贝数 高密度 高表达 防蛋白降解 分泌效率 翻译效率 转录水平
拷贝数对外源蛋白表达的影响——正 效应
CLARE, J. J. et al（1991）a
Mansur, M. et al（2005）
Vassileva. et al（2001）
Clare, J J. et al（1991）b
RQ
90 100 11
fermentation time（h）
毕赤酵母在甲醇诱导时的代谢途径示意图
AOX1 FLD1
PIP
PDI1 KAR2
ZWF1
DAK
GAP CIT1 PDH GLR1 TRR1
H2O2，ROOH，·OH
PYK2
外源基因PIP的转录差异分析
4.00
pip
2.74
PIP
relative ratio
0.50
0.50
1.50
cit
1.00
G0 G6
relative ratio
0.001.00
0.95 0.80
A3
0.00 G0 G6
PIP
A3
0.50 0.00 G0 G6 A3
ZWF1
relative ratio
1.50 1.00 0.50
1.50
gap
1.00 0.97 0.79
pyk
1.00 G0 0.93 G6 0.87 A3
0
10
20
30
40
50
60
70
fermentation time (h)
induction time (h)
多拷贝重组菌OUR比较
200 180 160 140
(mmol.L -1.h-1)
1.2 1-copy 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
RQ
200 180 160 140
OUR, CER (mmol.L -1 .h-1 )
1.2 6-copy CER OUR RQ 1.0 0.8 0.6 0.4
RQ
200 180 160
OUR, CER
120 100
120 100
0.2 0.0 80 60 40 20 0 0 10 20 -0.2 -0.4 -0.6
0.0 80 60 40 20 0 0 10 20 -0.2 -0.4
6.00 6.00 2.68 2.68
0G0
G6
6 G6
A3
18 A3
PIP蛋白的合成通量也随拷贝数的增加而增加了
抗氧化基因的转录差异分析
2.50
glr
1.68 1.00 1.15
relative ratio
2.00 1.50 1.00 0.50 0.00
PIP
0 G0
trr
6G6
18 A3
1.75
pH 氧化还原电位 溶解氧浓度 溶解 CO2 浓度 排气 O2 分压 排气 CO2 分压 其他排气成分
间接参数
摄氧率（ OUR ） 二氧化碳生成率（CER ） 呼吸商（ RQ ） 总氧利用 体积氧传递系数（KLa ） 细胞浓度（ X ） 细胞生长速率（Rx ） 比生长速率（μ） 细胞得率（ Y X / S ） 糖利用率 氧利用率 比基质消耗率（u ） 前体利用率 产物量（ P ） 比生产率（υ） 其他需要计算的值参数 功率、功率准数 雷诺数 细胞量 生物热 碳平衡 能量平衡
PART 1:r-Phytase
图 发酵不同时期RQ值
工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （3）：不同碳源启动时间

图7甘油为碳源时过渡阶段发酵过程OUR和DO曲线
图8 葡萄糖为碳源生长时过渡阶段发酵过程OUR和DO曲线
图 甘油为碳源时过渡阶段发酵过程OUR和DO
图 葡萄糖为碳源生长时过渡阶段OUR和DO曲线
1.0 0.8 0.6 0.4
RQ
140 120 100
140 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20
OUR, CER
0.2 0.0 80 60 40 20 0 0 10 20
-0.2 -0.4 -0.6
-0.2 -0.4 -0.6
诱导 补料
30 40 50 60 70 80
补料
3.00 2.00 1.00 1.00 0.00 0.00
0 G0
6 G6
18 A3
PIP的转录水平增加与拷贝数成正比
蛋白伴侣基因的转录差异分析
4.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 G0 G6 A3 1.43 1.00 1.00 1.43
pdi
pdi
3.14
relative ratio
relative ratio
1.00
0.百度文库0
0.00
0 G0
G6
6
18 A3
高拷贝菌株甲醇代谢途径发生显著变化
1.50
pdh
1.00 1.02
中心代谢途径关键酶基因的转录差异分析 1.50
zwf
relative ratio
1.00 1.00 0.93 0.85
0.73
relative ratio
1.00
工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （1）：不同碳源
图 3 葡萄糖为碳源时生长阶段发酵过程曲线图
图4 甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图
图 葡萄糖为碳源时生长阶段发酵过程曲线图
图
甘油为碳源时生长阶段发酵过程曲线图
PART 1:r-Phytase
工程植酸酶发酵过程特征跨尺度关联分析 （2）：不同阶段
Cos et al 2005 Hohenblum et al 2004
外源蛋白折叠分泌能力下降
Hohenblum et al 2004; Inan et al 2006
如何优化高拷贝数毕赤酵母菌外源蛋白表达 策略？
高拷贝菌株构建
6copy
29copy
重组毕赤酵母生长与表达
800
400 350 300 250