实验五. 细胞染色体制备知识讲解
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实验五
组织培养细胞染色体的制备
实验目的 实验原理 实验试剂与仪器 实验步骤 注意事项
一、实验目的
了解组织细胞的培养方法。 掌握染色体标本的制备方法。
二、实验原理
二、实验原理
处于指数生长期的细胞，经过短期培养后， 用秋水仙素处理，可把细胞分裂阻截在中 期，再经过低渗、固定、滴片和染色，就 可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可 以清楚地对染色体进行观察。
破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的 核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有 染色体形态
4. 染料 （ Giemsa ） 不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和 甲醇的混合物，配制后原液储存， 染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。
培养瓶
四、实验步骤
培养
秋水仙素
培养液4ml 胎牛血清1ml
培养24小时
• Chr9和Chr22相互易位
• 使得Chr9上的c-abl oncogene和 Chr22上的bcr gene相连，形成融合
基因。 • 其产物是一个融合蛋白 • 这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的
控制，导致白血病。 • 只要一个细胞带有这种易位Chr，就
会致病。
猫叫综合征（Cat cry syndrome）
2）低渗之后，要细心、温柔混匀细胞，防止细胞膜破裂、 染色体散失；
3) 离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之， 细胞易丢失；
4) 载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上；
实验步骤
1.秋水仙素预处理: 收集生长旺盛的细胞1ml，轻轻吹 打散，加入秋水仙素1ul，继续培养6-8小时（已完成 ）；
上清
加3ml固定液，轻 轻吹打后，固定 10min后，离心
去上清
7.
8.
9.
三次固定 （同6）
制片
预冷冰片
距离20cm以上 玻片倾斜30℃
迅速吹气
过火焰 3-5次
10.
11.
12.
空 气干燥
染色
Giemsa 染色10min
细水流冲洗
13.
14.
吹干
镜检
五、注意事项
1）秋水仙素处理时间要把握好，时间过长，分裂细胞多， 染色体短小；反之，则少而细长
6. 二次固定：加3ml固定液，吹打均匀，固定10min 后，1000rpm离心5min，去上清；
7. 三次固定：重复第6步；
8. 制悬液：去上清后剩0.5ml固定液，用吸管轻轻 吹打使其成为细胞悬液；
9. 滴片：将冰冷的载玻片倾斜30℃，吸取细胞悬液 距离载玻片至少1m滴于载玻片上，吹散，空气 干燥；
每ml培养液 加1ug
继续培养3-5小时
1. 取样
2. 离心
3. 低渗
取1ml培养液于 10ml离心管
1000rpm 离心5分钟
弃上清
加Cl 8ml 混匀
37℃处理20分钟
4. 预固定
5. 固定
6. 二次固定
加3-4滴固定液， 轻轻吹打后，离
心去上清
加3ml固定液， 2min后轻轻吹
打后，固定 10min,离心去
2. 预处理后的细胞，以1000rpm离心5min，去上清；
3. 低渗处理：加入1ml低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬 ，然后补加7ml低渗液，室温下静置20min
4. 预固定：加入3-4滴固定液后，轻轻混匀，避免粘 连，1000rpm离心5min，去上清；
5. 固定：沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸 管轻轻吹打，使细胞分散，固定10min后， 1000rpm离心5min，去上清；
10. 染色：在干燥的载玻片上滴Giemsa，染色 10min，细水冲洗后，空气干燥；
11. 镜检：在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色 适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
小鼠中期细胞染色体 （2N=40）
小鼠染色体核型分析
人类慢性骨髓性白血病 （chronic myelogenous leukemia）
三、实验试剂及仪器
材料：具有很强生长分裂能力的细胞系（Hela细胞、 白血病K562细胞、C2C12，BHK细胞等）
仪器：恒温培养箱、离心机、显微镜 培养瓶、移液管、载玻片
试剂：培养液（RPMI1640、M199、DMEM等）、 胎 牛 血 清 、 双 抗 、 NaHCO3 、 生 理 盐 水 、 肝 素 、 1.0g/L 秋 水 仙 素 溶 液 （ 0.1% ） 、 低 渗 液 （ 0.075M/L KCl）、固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)、Giemsa染液
• 临床表现： – 喉部发育不良，哭声似猫叫 – 身体与智能发育不全，小头畸形，满月形脸，眼距宽，低耳位，高鼻梁 – 在婴儿期或幼儿期夭折
• 病因： – 5号染色体短臂缺失，5p-综合征
1. 秋水仙素 ①阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。 ②使染色体收缩成一定的形状。 目的 : 获得大量的中期分裂相细胞。
2. Carnoy固定液 新配置的甲醇 ：冰醋酸混合液 (3:1)。 能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的 完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良 染色效果
3. 低渗液（ 0.075M/L KCl ） 低渗的目的是凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不
组织培养细胞染色体的制备
实验目的 实验原理 实验试剂与仪器 实验步骤 注意事项
一、实验目的
了解组织细胞的培养方法。 掌握染色体标本的制备方法。
二、实验原理
二、实验原理
处于指数生长期的细胞，经过短期培养后， 用秋水仙素处理，可把细胞分裂阻截在中 期，再经过低渗、固定、滴片和染色，就 可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可 以清楚地对染色体进行观察。
破裂）染色体铺展，同时可使粘附于染色体的 核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有 染色体形态
4. 染料 （ Giemsa ） 不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和 甲醇的混合物，配制后原液储存， 染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。
培养瓶
四、实验步骤
培养
秋水仙素
培养液4ml 胎牛血清1ml
培养24小时
• Chr9和Chr22相互易位
• 使得Chr9上的c-abl oncogene和 Chr22上的bcr gene相连，形成融合
基因。 • 其产物是一个融合蛋白 • 这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的
控制，导致白血病。 • 只要一个细胞带有这种易位Chr，就
会致病。
猫叫综合征（Cat cry syndrome）
2）低渗之后，要细心、温柔混匀细胞，防止细胞膜破裂、 染色体散失；
3) 离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之， 细胞易丢失；
4) 载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将材料滴在玻片上；
实验步骤
1.秋水仙素预处理: 收集生长旺盛的细胞1ml，轻轻吹 打散，加入秋水仙素1ul，继续培养6-8小时（已完成 ）；
上清
加3ml固定液，轻 轻吹打后，固定 10min后，离心
去上清
7.
8.
9.
三次固定 （同6）
制片
预冷冰片
距离20cm以上 玻片倾斜30℃
迅速吹气
过火焰 3-5次
10.
11.
12.
空 气干燥
染色
Giemsa 染色10min
细水流冲洗
13.
14.
吹干
镜检
五、注意事项
1）秋水仙素处理时间要把握好，时间过长，分裂细胞多， 染色体短小；反之，则少而细长
6. 二次固定：加3ml固定液，吹打均匀，固定10min 后，1000rpm离心5min，去上清；
7. 三次固定：重复第6步；
8. 制悬液：去上清后剩0.5ml固定液，用吸管轻轻 吹打使其成为细胞悬液；
9. 滴片：将冰冷的载玻片倾斜30℃，吸取细胞悬液 距离载玻片至少1m滴于载玻片上，吹散，空气 干燥；
每ml培养液 加1ug
继续培养3-5小时
1. 取样
2. 离心
3. 低渗
取1ml培养液于 10ml离心管
1000rpm 离心5分钟
弃上清
加Cl 8ml 混匀
37℃处理20分钟
4. 预固定
5. 固定
6. 二次固定
加3-4滴固定液， 轻轻吹打后，离
心去上清
加3ml固定液， 2min后轻轻吹
打后，固定 10min,离心去
2. 预处理后的细胞，以1000rpm离心5min，去上清；
3. 低渗处理：加入1ml低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬 ，然后补加7ml低渗液，室温下静置20min
4. 预固定：加入3-4滴固定液后，轻轻混匀，避免粘 连，1000rpm离心5min，去上清；
5. 固定：沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸 管轻轻吹打，使细胞分散，固定10min后， 1000rpm离心5min，去上清；
10. 染色：在干燥的载玻片上滴Giemsa，染色 10min，细水冲洗后，空气干燥；
11. 镜检：在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色 适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
小鼠中期细胞染色体 （2N=40）
小鼠染色体核型分析
人类慢性骨髓性白血病 （chronic myelogenous leukemia）
三、实验试剂及仪器
材料：具有很强生长分裂能力的细胞系（Hela细胞、 白血病K562细胞、C2C12，BHK细胞等）
仪器：恒温培养箱、离心机、显微镜 培养瓶、移液管、载玻片
试剂：培养液（RPMI1640、M199、DMEM等）、 胎 牛 血 清 、 双 抗 、 NaHCO3 、 生 理 盐 水 、 肝 素 、 1.0g/L 秋 水 仙 素 溶 液 （ 0.1% ） 、 低 渗 液 （ 0.075M/L KCl）、固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)、Giemsa染液
• 临床表现： – 喉部发育不良，哭声似猫叫 – 身体与智能发育不全，小头畸形，满月形脸，眼距宽，低耳位，高鼻梁 – 在婴儿期或幼儿期夭折
• 病因： – 5号染色体短臂缺失，5p-综合征
1. 秋水仙素 ①阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂。 ②使染色体收缩成一定的形状。 目的 : 获得大量的中期分裂相细胞。
2. Carnoy固定液 新配置的甲醇 ：冰醋酸混合液 (3:1)。 能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的 完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良 染色效果
3. 低渗液（ 0.075M/L KCl ） 低渗的目的是凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不