蛋白质组研究技术及进展

收稿日期:2006-09-30

作者简介:郝会军(1977 ),男,陕西府谷人,潍坊职业学院讲师,硕士。主要研究方向:植物营养。

蛋白质组研究技术及进展

郝会军,刘 英,丁雪珍,陈美霞

(潍坊职业学院,山东 潍坊 261031)

摘 要:本文主要介绍了蛋白质组的含义以及蛋白质组研究的核心 用于分离的双向式电泳(2-DE )技术和主要的蛋白质鉴定技术包括图象分析技术、微量测序、与质谱相关的一些应用技术,同时,对蛋白质研究的新进展如双向电泳数据库和蛋白质组数据库,作简要介绍。

关键词:蛋白质组;双向凝胶电泳;蛋白质鉴定;数据库 中图分类号:O629.73

文献标识码:A

蛋白质组!由澳大利亚学者W il k i n s 和W il lia m s 等于1994年提出,指的是由基因组编码的全部蛋白质

∀1#

。今后生命科学的重点将是在蛋

白质组水平上揭示生命现象的本质及活动规律。蛋白质组学就象基因组学一样,不是一个封闭的、

概念化的稳定的知识体系,而是一个领域。蛋白质组学集中于动态描述基因调节,对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定,鉴定疾病、药物对生命过程的影响,以及解释基因表达调控的机制∀2#

。作为一门科学,它是已有20年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸。下面就蛋白质组研究的主要分析技术及最新进展作一简要综述。

1 蛋白质组研究的核心 用于分离的双向式电泳(2-DE )

蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。双向电泳由O 'Farrells '∀3#

于1975年首次建立并成功地分离了约1000个E .co li 蛋白。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点在p H 梯度胶中等电聚焦,然后按照它们的分子量大小进行SDS-PAGE 第二次电泳分离。目前,随着技术的飞速发展已能分离出10000个斑点∀4#

。当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候,蛋白质组的分析变得可行。

样品制备和溶解同样事关2-DE 的成效,尽可能进行扩大其溶解度和解聚的工作,以提高分辨率是目标所在。目前,用化学和机械裂解法破碎,以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作

用。对I E F(isoelectr i c focusing)样品的预处理涉

及溶解、变性和还原来破坏蛋白质间的相互作用,并除去如核酸等非氮物质。理想的状态是人们应一步完成蛋白的全部处理

∀5#

。近来,在 变性剂

鸡尾酒!中,含14~16个碳的碳基甘氨酸三甲内盐(ASB14-16)的裂解液效果最好∀6#

。机械力被用来对蛋白分子解聚,如超声破碎

∀7#

等。另外,

添加P M SF 等蛋白酶抑制剂∀8#

,可保持蛋白完整

性。

2-DE 面临的挑战是高分辨率和完整性。高分辨率和重复性。高分辩率确保蛋白最大程度的分离,高重复性允许进行凝胶间配比。对2-DE 而言,有3种方法分离蛋白:1)ISO -DALT (isoe lectric focus)以O 'Farrell 's 技术为基础

∀8#

。向应

用载体两性电解质(carrier a m pholyte ,C A ),在管胶内建立pH 梯度。随着聚焦时间延长,p H 梯度不稳,易产生阴极漂浮。2)NEP HGE (non-equi li b ri u m p H gradient electrophoresis)

∀9#

用于分离碱

性蛋白(pH >7.0),如果聚焦达到平衡状态,碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失。因此,在等电区域的迁移须在平衡之前完成,但很难控制。3)I PG -DALT 发展于上世纪80年代早期。由于固相p H 梯度(I m m obilized p H gradien,t I PG )

∀9#

的出现

解决了p H 梯度不稳的问题。目前,可以精确制作线性、渐近性和S 型曲线,范围或宽或窄的p H 梯度。新的酸性p H 3~5或碱性p H 6~11的I PG 凝胶梯度联合商品化的pH 4~7的梯度,可以对蛋白质形成蛋白质组重叠群(pr o teo m i c conti g s)

∃

46∃第3卷第1期潍坊高等职业教育

V o.l 3N o .12007年3月W e ifang H igher V ocati onal Educa tion M a r .2007

进行有效分离∀10#。

较早期比较,2-DE有两个主要进步:首先,极高的重复性使有机体的参考图谱,可通过Inter net获得,来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次,高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术。

2 主要的蛋白质鉴定技术

如果目前分离蛋白质的最好技术是2-DE,那么,随之而来挑战是成百上千个蛋白如何被鉴定。在这里,我们对传统方法,如Edm an降解法,免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的分析不作介绍。并不是因为这些方法无效,而是因为它们通常耗时、耗力,不适合高流通量的筛选。目前,所选用的技术包括对于蛋白质鉴定的图象分析、微量测序;进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组合分析和与质谱有关的技术。在此,限于篇幅也仅稍作介绍。

2.1图像分析技术

满天星!式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉,每一个图像上斑点的上调、下调及出现、消失,都可能在生理和病理状态下产生,必须依靠计算机为基础的数据处理,进行定量分析,在一系列高质量的2-DE凝胶产生(低背景染色,高度的重复性)前提下,图像分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。

2.2微量测序

蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石,可以提供足够的信息。近来,应用自动化的Edm an降解可产生短的N-末端序列标签,这是将质谱的序列标签要领概念用于Ed m an降解,业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。当对Edm an 的硬件进行简单改进,以迅速产生N-末端序列标签达10~20个/天,序列标签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其它的蛋白质属性,如氨基酸组份分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点,可以更加可信的鉴定蛋白质。选择BLAST程序,可与数据库相配比∀11#。目前,采用一种Tag ladent的检索程序,还可以进行种间比较鉴定,又提高了其在蛋白质组研究中的作用∀12#。

2.3与质谱相关的技术

质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术,开启了大规模自动化的蛋白质之门。质谱技术的基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子间的质荷比(m/z)的差异来分离并确定分子量。2.3.1肽片段测定

采用串联质谱(Tande m-M S),即在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子,与惰性气体碰撞,使肽链中的肽键断裂,形成一系列离子,即N-端碎片离子系列(Y系列),将这些碎片离子系列综合分析,可得出肽段的氨基酸系列。最近,W il m等应用钠喷串联测得肽段系列∀13#。在MALDI-MS方面,近年来可用源后衰变-基质辅助激光解吸质谱(post-source decay MALD I-M S,PSD-MALDI-M S)技术测得肽序列∀14#。

2.3.2脂质指纹技术

脂质指纹技术(peptide m ass fi n gerpri n,t P M F)是由H enze l等人∀15#于1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白质在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂,断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALD I-TOF-M S或为ESI-MS),这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来断裂!蛋白所产生的)。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片数目作一排行榜,冠军!肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠军之间的肽片段存在较大差异,且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好,则说明正确鉴定的可能性较大∀16#。

3 蛋白质研究新进展

3.1双向电泳数据库和蛋白质组数据库

在蛋白质组概念提出之前,许多基于双向凝胶电泳图谱和蛋白质鉴定分析资料的数据库不断建立和完善。最近的S W I SS-2DP AGE数据库已包括来源于人类肾脏、肝脏、脑脊液、红白血病细胞株和大肠杆菌等15种双向电泳参考图∀17#。该数据库还包括被鉴定蛋白的实验数据、生理和病理等信息,并与其它2-DPAGE数据库和S W I SS -PROT联接。第一个完整的蛋白质组数据库-酵母蛋白质数据(Y east Pro tein Database,YPD)已于1997年由G arre ls为首的美国麻省蛋白质组公司创建∀18#。YPD包括了酵母大约6000种蛋白质(已知的和从DNA开放阅读框推测的蛋白质)的报告。对每种蛋白质的特性(如分子量、等电点)、已知蛋白的亚细胞定位、翻译后修饰、生物功能等进行描述和注解,并容纳了大量参考文献。

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第1期郝会军,刘英,丁雪珍,陈美霞:蛋白质组研究技术及进展