激素及激素代谢产物的测定

第十二章激素及激素代谢产物的测定

体液中激素及其代谢产物的浓度甚微，如血液中的浓度往往在每100ml只有数微克水平，24h尿液中的浓度也只有数微克至数毫克水平，因此要求具有极其灵敏而特异的方法才能进行测定。比色法灵敏度不够高，但由于操作简便，不需特殊设备，仍作为常规测定方法，如尿中17-酮类固醇、17-羟皮质类固醇的测定。荧光法的灵敏度较比色法高约100倍，尿儿茶酚胺的测定可采用此方法。放射免疫法因具有灵敏度高、特异性强等优点，几乎全部激素均可用这种方法进行测定。但由于放免法受放射性物质的限制，短半衰期的限制，125I标记物灵敏度的最低值限制等限制了这项技术的发展。于是酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、时间分辨荧光免疫测定法等得到了长足的发展，且已越来越多地应用于激素及其代谢产物的测定。

实验71 ELISA法测定人绒毛膜促性腺激素

人胎盘绒毛滋养叶细胞合成与分泌的人绒毛膜促性腺激素((human chorionic gonadotropin,hCG)是一种由α和β亚基构成的糖蛋白(分子量36 000)。其α亚基的肽链组成与结构和来自脑垂体前叶的糖蛋白激素促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)相类似。而绒毛膜促性腺激素β亚基(β-hCG)则具有特异性，系hCG的生物活性所在。故测定β-hCG交叉反应小，特异性高，能准确地反映hCG的水平。

【原理】二点酶免疫分析法的原理是先将抗β-hCG亚基单克隆抗体(McAb)包被固相载体(如聚苯乙烯反应板微孔)，再加入检样与酶标记的抗β-hCG亚基McAb，如检样中有hCG 存在，则可形成夹心式结合物，加入底物后出现呈色反应。因采用对hCG特异的抗-β亚基McAb包被，故特异性较高。

【试剂】酶免疫法测hCG试剂盒。最主要的试剂包括：

1．包被固相载体用的β-hCG亚基McAb。

2．辣根过氧化物酶(HRP)标记的β-hCG亚基的McAb。

3．在HRP反应体系中作底物(供氢体)的四甲基联苯胺(TMB，目测呈蓝色)或邻苯二胺(OPD，呈现黄色)。

【操作步骤】二点酶免疫法

1．标本

(1) 尿液：以1 500～2 000r/min离心10min。清晨尿hCG水平最高，接近于血清水平，

通常收集晨尿送检。

(2) 血清：不加抗凝剂，尽快分离血清进行检测。

2．在已包被抗β-hCG亚基McAb的聚乙烯反应板微孔中加最适浓度(说明书指定)酶标记抗β-hCG亚基McAb 0.1ml，立即加尿或血清0.1ml。

3．轻轻抖动反应板，或于混匀器上混匀30s，再置37℃20min。

4．甩去孔内反应物，以蒸馏水冲洗6次，晾干。

5．加底物溶液0.1ml，室温放置5min，观察。蓝色(底物为TMB-H2O2时)或黄色(底物为OPD-H2O2时)为阳性，无色为阴性。如需定量，可同时做一标准系列浓度，结果以lgC对吸光度作图，待测样本浓度可从曲线中查出。

【参考范围】正常人hCG＜1.0μg/L。

【临床意义】

1．可用于早孕诊断。正常育龄妇女hCG升高提示早孕。

2．作为绒毛膜上皮细胞癌、葡萄胎的早期诊断指标。

3．可用于对绒毛膜上皮细胞癌、葡萄胎手术后化疗效果观察，是有效随访监测的手段。

【评价】早期采用的生物学方法由于所选择的试验测试对象的个体差异及对试验条件的反应性不同，使得定性测试结果差异较大。

随后出现凝集抑制试验，在试验中引入凝集抑制试验及免疫学的技术，使得灵敏度、准确度、精密度有了一定的提高，检测时间进一步缩短(最快速检测3～5min完成定性)。通过对抗体的纯化标记技术的改进，引入了同位素标记及酶标记技术，极大地提高了检测灵敏度、准确度、精密度，使hCG测定从定性转化为定量，极大地满足临床的需要。

现今较常用对血清、尿液等的定量分析方法为竞争性结合的放射免疫法及固相双抗体夹心酶联免疫吸附试验，化学发光免疫分析也已应用于临床。

(刘忠民)

实验72 酶标免疫荧光法测定血清皮质醇

皮质醇(Cortisol)又称氢化可的松、化合物F、糖皮质类固醇。

血液中皮质醇浓度直接反映肾上腺糖皮质激素分泌情况，而尿中游离皮质醇(Urine free cortisol，UFC)由血液中游离皮质醇经肾小球滤过而来，因此其量与血浆中真正具生物活性(包括调节自身分泌)的游离皮质醇浓度成正比。血浆(清)皮质醇或24h UFC测定现被推荐为是否存在肾上腺皮质功能紊乱的临床生化检查首选项目。

目前皮质醇测定方法有荧光光度法、免疫化学法、HPLC、GC、GC-MS等。其中，荧光法因受多种内源性皮质激素及其前体物如皮质酮、11-去氧皮质醇(甲吡酮抑制试验时可能大量出现)等干扰，特异性较差，测定结果较其他方法偏高。HPLC、GC、GC-MS法虽然特异性、灵敏度均高，但难以在临床常规工作中使用。免疫化学法除特异性及灵敏度均可满足要求外，其操作简便、快速、且有商品试剂盒供选用，为目前最常使用的方法。

【原理】以皮质醇-C21-半琥珀酸在低温下进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，得到高活力的酶标记物。抗体包被于微孔滴定板上，采用竞争抑制原理进行反应，后用对羟基苯丙酸(HPPA)作为荧光试剂，测定血中皮质醇，代替放射免疫中的同位素标记，从而建立酶标免疫荧光测定法(F-EIA)。

【试剂】

1．辣根过氧化物酶(HRP)。

2．对羟基苯丙酸(HPPA)。

3．皮质醇抗体。

4．皮质醇-C21-半琥珀酸。

5．包被缓冲液0.05mol/L NaHCO3-Na2CO3(pH9.6)。

6．测定缓冲液0.12mol/L PBS(pH7.0～7.2)。

7．洗涤缓冲液(PBST，pH7.0～7.2)，每1 000ml PBS中加0.5ml Tween-20。

8．荧光试剂①Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)；②0.5% HPPA和0.05% H2O2，临用前以1:1(V/V)新鲜配制。

9．终止液2mol/L NaOH。

【测定】

1．抗原的酶标记采用混合酸酐法。取皮质醇-C21-半琥珀酸3.1mg，二氧六环0.2ml，三正丁胺10μl，氯钾酸异丁酯4μl，在4℃反应30min，滴加入HRP 7.1mg/ml中，整个溶液保持在pH8～8.5，水浴反应4h，测定缓冲液透析48h，用Sephadex G50柱层析(50cm×1.5cm)，洗脱液为0.05mol/L PBS(pH7～7.2)，用部分收集仪收集每管1ml，共30管，用分光光度计405nm波长测吸光度，取高值管加0.2%牛血清白蛋白(BSA)PBS稀释4倍，保存4℃备用。

2．微孔板的抗体包被首先将酶标板洗净，除第一列ABCD四孔外，每孔加皮质醇抗体(1：15 000)200μl，4℃过夜，次日弃去板中液体，并用冲洗液洗涤三次，甩干。包被板可保存1周。

3．将血清用测定缓冲液对倍稀释，置60℃10min，以破坏血清中皮质类固醇结合球蛋白(CBG)，取经处理后血清100μl置于抗体包被的微孔内，然后加酶标记抗原100μl (1：1