植物激素的测定方法

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注意事项 ：
（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
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加 抗体
➢在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加 50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
➢竞争条件37℃左右0.5h。
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洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
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包被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后 将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷 盘内。
• 37 ℃下1.5小时。
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洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
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比色
在酶联免疫分光光度计上依次 测定标准物各浓度和各样品490nm 处的OD值。
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数据分析
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔， 在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值， 以OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐 标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的 OD值在标准曲线上查出待测样品的ABA含量的对数。 利用反对数求得ABA的绝对含量。
• 完全抗原
半抗原
+
(complete antigen)
• 半抗原(hapten)
• 载体(carrier)
载体
完全抗原
B B
B
BT T
抗体
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抗体（Ab）
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一、基本概念：
• 抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增 殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要 存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性 地结合，具有免疫功能。
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加底物显色
在每孔中加100μl 邻苯二胺（OPD）溶液 （小心勿用手接触OPD），（每10ml溶液中 含4μl 30% H202。混匀，然后放入湿盒内， 当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色 梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加 入50μl 2mol/L硫酸终止反应。
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几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
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操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--洗涤---显色---比色---计算
竞争
➢ 即加标准物、待测样和抗体。 ➢ 加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成： ABA
标准曲线的最大浓度为100ng/ml,然后再依次2倍稀 释8个浓度（包括2个0ng/ml，加入前两行的最后两 排 ）。将系列标准样加入96孔酶标板的1、2、3行， 每个浓度加3孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个 样品重复3孔，每孔50μl。
酶联免疫吸附试验 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
原理（以间接性ELISA为例）：
显色
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抗原
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医学上重要的抗原
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• 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指 具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋 白
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二、免疫球蛋白的分子结构
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免疫球蛋白的基本结构
• 四肽链结构 ，链间二硫键连接 • 两条重链（H）和两条轻链（L） • 氨基端和羧基端。
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植物激素的测定方法？
➢生物活性法 ➢气相色谱（气-质联机） ➢液相色谱（液-质联机） ➢酶连免疫法（ ELISA 法）
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问题：我们该选择哪种板呢？
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抗原的概述
• 抗原（Ag）是指能与淋巴细胞抗原受体 特异性结合，刺激机体免疫系统产生特 异性免疫应答，并能与相应免疫应答产 物在体内、外发生特异性反应的物质
• 抗原的两个基本特性
– 免疫原性（immunogenicity) – 免疫反应性 (immunoreactivity)
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加“二抗”
将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释 液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混 匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入 湿盒内，置37℃下，温育0.5h。
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洗板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一 次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着 加第2次。共洗涤3次。
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可变区与恒定区
• 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C）
• 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较 大
• 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序 及 含糖量都比较稳定
ELISA技术的特点与局限性
（1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性 物质形成"免疫吸附剂"；酶标记免疫活性物 质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗 涤过程；灵敏度特异性相对较高。
（2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精 密 度 差 （ 批 内 CV15-20% ） ； 线 性 范 围 窄 （一个数量级）。