细菌鞭毛染色的方法

细菌鞭毛染色的方法

目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸，染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀（tar and feather）”，鞭毛直径加粗，进一步染色后即可在油镜下观察。

1. 碱性复红法和副品红法：1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液

2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Ne elsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C 为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。

2. 结晶紫法：又称Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸1 0 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu

染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想.

3. 维多利亚蓝B法：1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7min。该试剂保存期约为6个月，关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价，很难判断其染色效果。

4. 镀银染色法：1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液：10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液，再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，稳定10 min后使用。银染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用，再缓慢加入浓氨水（比重0.880）使形成的沉淀刚好重新溶解，最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。用媒染液染片3～5min，蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色3～5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁，所以1965年Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A：100 ml蒸馏水中加入5 g单宁酸，1.5 gFeCl 3，15%福尔马林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。试剂B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但试剂不稳定，要求在4h内使用，并用要用氨水调pH至10。试剂A染片2～4min，试剂B染色30 s，不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片，未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年，West等对镀银染色法进一步改良，制备涂片时直接使用血平板，评价染色效果首次使用5分制，通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方：媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml，10%单宁酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价，包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h；血琼脂平板35～37℃，培养18～24h。评价结果血琼脂平板35～37℃，培养18～24h不适于细菌鞭毛染色，而半固体动力培养基和T SA斜面25℃，培养18～24h适合于细菌鞭毛染色，同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能

有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定，需避光5℃保存，1992年Porter等继续改良该方法，其试剂配方同West等的方法，只是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为8 min，染色液不需加热，只染30 s，制备涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培养24h，但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌（奇异变形杆菌）进行研究。于是1994年Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果，并使用4种细菌（绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板，26℃培养24h。试剂配方仍不变，媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色，媒染液染色8 min，银染液染色30～60 s，不需加热。这4种细菌均染色成功，从而证明媒染液可至少放置16周。

5、鞭毛的负染：具体操作：菌悬液，直接滴在铜网上，1－2分钟后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷钨酸溶液，1分钟后，吸去多余的染液，然后就可以在电镜下观察了。一般染色后十五天之内看电镜。时间太长效果不好。这是我试验用的方法。

6、我喜欢用银染法，曾做过一段时间的细菌鉴定，以下是我一些染色心得：首先染色用玻片一定要干净，洗液泡过之后蒸馏水冲洗干净。涂片的时候菌千万别涂得太多。第一部染色时，可将玻片置于水浴锅内，温度保持在35度,盖上盖（主要是保持一定的湿度，防止染色液变干不利于冲洗，这步非常有用)。一定要将第一步使用的媒染液冲洗干净，否则影响染色效果，背景可能非常脏。其他的步骤参考书上的资料进行，一般没什么问题。我用这种方法染单鞭毛的弧菌，效果非常好。

注意事项：

1. 要注意培养条件和培养时间：①用点接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固体平板上接种。一般一个平板点接3～4处。经比较用半固体培养基培养出来的菌体活动度大，鞭毛长且多，易于染色，这可能与半固体培养基更适于菌体运动、鞭毛生长较好有关。用点接种法在平板上接种更易于挑取边缘幼龄的菌体。②培养时间要严格掌握，一般培养9～12h较好，菌龄超过15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。

2.染色过程中的细节也应充分注意：①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。④A染液染3～5 min，其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则加B染液后，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。⑤加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽，30～60 s，染色效果较不加热为好。⑥B染液染完后，用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。