小鼠肾细胞分离制备及培养方法 2

小鼠肾细胞分离制备及培养方法

实验目的：原代肾细胞作为一种常用的肾脏毒理学研究对象，其分离方法主要有机械研磨分离法和酶消化法,酶消化法因对细胞损伤小、分离效果好而优于机械研磨分离法。酶消化法主要是胰蛋白酶消化法和胶原酶消化法,，本实验为了达到更好的效果，决定将这两种消化法结合使用,。体外培养肾细胞是一种可以精确模仿体内肾脏活动的简单系统。通过研究肾细胞体外培养可以解决临床上供体肾短缺问题，为治疗慢性肾功能衰竭等疾病，提供了肾脏移植基础条件。

实验材料：

○1实验动物：小鼠

○2主要仪器及试剂：高压蒸气灭菌锅"离心机"烘干箱"水浴锅"超净工作台""1460 培养基"小牛血清"胰蛋白酶和IV型胶原酶"75% 乙:醇" .

○3胶原酶消化液：含0.05%IV型胶原酶,24mg/ml Hepes,3.9mg/ml NaCl,

0.5mg/ml KCl, 0.7mg/ml CaCl2.2H2O;胰蛋白酶消化液:含

0.05%胰蛋白酶,0.02%EDT A,8.0mg/ml NaCl,0.4 mg/ml KCl,

0.06mg/ml Na2HPO4.H2O, 0.06mg/ml KH2PO4, 0.35mg/ml,0.35mg/mlNaHCO3。

○4RPMI1640培养液:含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100Ug/ml链霉素;MEM培养液:含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100Ug/ml链霉素。

实验步骤：○1肾细胞分离将大鼠脱颈椎处死,无菌取肾,剪取肾皮质部分,移入小烧杯内,剪成1mm3左右的组织块,用生理盐水反复冲洗,吸弃上清液,将沉淀用于以下试验。

○2胶原酶、胰蛋白酶两步消化法：将组织碎块中加入足量胶原酶消化液,37水浴振荡消化5分钟后,用吸管吹打数次,吸取:上清存于4e冰箱内,剩余组织块继续加入胶原酶消化液37e水浴振荡消化,每隔5分钟,用吸管反复吹打,收集上清,直至组织块消化完全。收集所有上清在4e、800rPmin下离心5分钟,倾除消化液,得到的沉淀中加入足量胰蛋白酶消化液,37e 水浴振荡消化5分钟后,加入含10%血清的培养液以终止消化反应,吸管反复吹打,800rPmin 下离心5分钟,弃掉上清,将沉淀等分成两份,分别用RPMI1640培养液和MEM培养液分装在培养瓶内,在37e、5%CO2的培养箱中培养。

或这个实验步骤将新生小鼠断颈处死，消毒，于超净工作台上解剖，取肾脏，Hank’s液洗涤!剪切成1mm3

左右的小块!将组织块置于离心管中，加入胰蛋白酶液!放置在37e恒温水浴锅中消化，每5min 摇动 1 次，30min后取出，不去除组织块!以1000r/min 低速离心10min，弃上清液，加培养液轻轻吹打形成细胞悬液，置于培养瓶内，加入小牛血清1ml 和培养液4ml，盖好瓶盖，置于培养箱中培养.

细胞培养原代肾细胞培养24小时后第一次换液,将培养液连同未贴壁的肾细胞及组织弃去,48小时后第2次换液,经D-Hanks液反复洗涤后,将贴壁的肾细胞用胰蛋白酶消化液消化成单个细胞,

结果与分析

用倒置相差显微镜对原代培养细胞进行观察

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