人胃癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体方法及步骤

人胃癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体方法及步骤
以反复接种传代于裸鼠皮下的SGC-7901 人胃癌细胞株建立的移植瘤组织块为材料，将其用生物吻合OB胶原位粘贴于裸鼠胃壁，并与传统"胃囊法"、”皮下移植法“比较观察移植肿瘤的生长情况、移植成功率和自发转移的发生率。

一、实验材料准备
6周龄BALB/c 无胸腺裸鼠24只，雌雄兼用，体重18-20 g。

传代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌细胞株，本实验肿瘤组织为第6代。

二、人胃癌SGC-7901组织块制备
1. 无菌条件下取人胃腺癌SGC-7901J标本中的组织数块，直径约0.5-1.0 cm，去除坏死组织，漂洗，滤纸吸干后置RPMI-1640液中剪成1-2 mm 的小块，制备成单细胞悬液（5×108-
2.5×1011 /L）。

2. 置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种，逐日观察，待肿瘤长至1.0-1.5 cm时处死裸鼠，取出肿瘤组织按上述方法传代，传代瘤鼠与实验用鼠同为BALB/c无胸腺裸鼠，本组瘤源为第6代。

三、模型的建立
1. 将24只健康裸鼠随机分为3 组，即皮下移植组、胃囊法组和OB胶粘贴组，每组8只。

2. 将传代瘤鼠拉颈处死，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，切成1 mm ×1 mm×1 mm小块，置于生理盐水中备用。

3. 皮下移植组：将切好的瘤块置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种。

4. 胃囊法组：腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠，无菌条件下沿左侧正中旁线切开，刀口约1.5 cm，小心暴露腹膜、胃壁，在胃壁缝制粘膜小囊，将肿瘤组织块包埋于其中，缝合关腹。

5. OB胶粘贴组：腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠，常规消毒皮肤，沿左侧正中旁线切开，刀口约1.5 cm处小心暴露腹膜、胃壁，用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆肌层，以出血为度，将肿瘤组织用医用吻合OB胶粘合在破损处，用0号线缝合腹膜腹壁，关腹。

四、处死动物及观察移植瘤转移情况
1. 12 周后，裸鼠出现消瘦、活动受限、倦呆乏力等衰竭症状，部分裸鼠瘤体突出至皮下，呈蛙形腹，将裸鼠拉颈处死，肉眼观察8 组移植瘤的局部生长、腹水、邻近淋巴结以及远处脏器转移情况。

2. 解剖动物，全面探查胸腹腔，取出原位移植瘤、肿大淋结、肝、脾、胰、肺，并测量
各组移植瘤的体积，同时用电子天平称取瘤重。

3. 标本用10%甲醛固定、切片、染色后进行病理组织学检查。

五、人胃腺癌SGC-7901细胞染色体标本制备
1. 在无菌条件下，剪取部分原位移植瘤组织，放于无血清RPMI-1640培养液中，进行原代细胞培养。

2. 待细胞生长旺盛并长成单层时即可进行第一次传代，并制作染色体标本。

3. 在40倍光镜下观察，并用显微摄影机摄下一个细胞染色体的中期分裂相。

六、统计学方法
所有统计应用SAS 6.12软件包，定量资料采用t检验，必要时采用单因素方差分析，定性资料采用x2 检验。

注意事项
人癌转移模型的原位移植战略是目前国际上普遍接受的研究人癌侵袭和转移的重要理论基础，理想的胃肠肿瘤动物模型应该具备以下条件：（1）致癌方法简单、易行；（2）经济、快速；（3）指标客观、明确；（4）对癌变器官的特异性高；（5）重复性好；（6）诱发肿瘤的病理类型、生物学行为、电镜下表现及组织化学改变等应与人体肿瘤相类似。

种植于裸鼠皮下生长的人胃癌组织，在形态、功能、生化特征等方面与人胃癌十分相似，但因其周围有结缔组织包裹，即便是选用高转移性的肿瘤，也仅仅形成局部肿瘤，限制了其浸润及转移。

原位移植模型则能够克服这一限制。

结果表明移植瘤发生局部浸润、淋巴结转移及远处它脏转移，且转移率较高，部分有腹水形成，而且较好地保持了原始肿瘤的组织结构和细胞形态、功能、生化特征，转移的发展也具有与临床胃癌患者基本一致的规律，与皮下移植模型比较具有显著优越性。

许多学者认为肿瘤转移不仅与其生长环境有关（土壤学说），还取决于其本身的转移潜能（种子学说），即依赖于肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与间质、肿瘤细胞与宿主之间的相互作用，激活细胞分泌蛋白降解酶类，降解基底膜，此过程还能诱导肿瘤细胞血管产生，通过信号转导系统激活细胞的移动性，这些都是肿瘤浸润转移所必须的过程。

本实验采用的OB胶粘贴法造模仍然沿用当前公认的完整组织块法建立类似于人胃癌临床转移的原位移植裸鼠模型，既有原位移植的优点，又保持癌组织的完整结构，避免了细胞表面结构遭到破坏而导致恶性肿瘤生物学行为和自然属性、恶性程度的改变，能更好地模拟临床肿瘤发生与发展的过程；同时将手术方法经过适当的改进，用OB 胶粘贴取代了传统的胃囊法，操作相对简便，手术时间大大缩短，对裸鼠的创伤小，术中出血少，术后恢复相对较快，故活率明显提高；另外选用胃大弯处，因其近胃窦旁血管稠密，血液供应丰富，肿瘤生长迅速，多数可以出现幽门梗阻、腹水、远处脏器转移及恶病质等表现，能够较好地重现胃癌的临床转移过程，为人类胃癌的生长、转移机制及抗转移治疗方面的研究提供了一种较理想的动物模型；本方法操作简便，不需专业人士造模，费用相对较低，有推广的价值。

因此，采用OB胶粘贴法建立胃癌原位移植模型是目前研究人胃癌转移机
制以及抗转移治疗较为理想的转移实验模型，该模型的成功建立为今后胃癌实验研究开辟了广阔的前景。