环境微生物菌种鉴定
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企业生产过程微生物 污染控制实例分析
--无菌制剂生产过程微生物菌库的建立和种属鉴定
辽宁省食品药品检验所抗生素室 张亚杰 2012.5
PPT课件
1
一、立项目的 二、采样方案 三、试验材料及仪器设备 四、鉴定方法 五、鉴定结果 六、结果分析 七、讨论
PPT课件
2
一、立项目的
（1）为了了解无菌制剂生产过程中微生物污 染情况，即微生物种类及分布情况，实现生产 环境微生物、操作过程微生物与药品中污染微 生物的比较和溯源分析，以便达到生产过程微 生物实时有效动态控制目的。从而满足药品 GMP对无菌制剂生产过程中微生物污染的监测 和控制要求。 （2）生产企业也可以利用这些数据，对无菌 制剂生产过程进行微生物风险评估。
的检出率为12.5%。
微生物采样点分布图见图1和图2。其中一 车间采样点共39个，二车间采样点共98 个。
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5
1. 采样区域的确定（一车间）
PPT课件
6
1. 采样区域的确定（二车间）
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7
2.采样对象及方式的确定
人员：手套印记 表面接触（头、胸、 手腕、肘、膝盖）
环境：沉降菌（ A级、B级、 C级）
首选的复壮及纯化培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基 （TSA）;对于革兰氏阴性菌，在无法与革兰氏阳性菌区分 的情况下，也会选择MaC琼脂作为纯化培养基；对于较难 培养的菌株，也采用血平板、改良MRS琼脂等进行纯培 养。
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四、鉴定方法
短小芽孢杆菌
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16
四、鉴定方法
溶血葡萄球菌
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Compact），根据革兰染色结果选择鉴定卡。 （2）将24小时培养物，用0.45%无菌氯化钠
溶液制备一定浊度的菌悬液，将64个生化反应 集成到Viteck鉴定卡上，一般2-10小时左右给出 鉴定结果 。
（ 3 ） 结 果 判 断 ： 相 似 度 96%-99% 为 极 好 ， 95%-92% 为 较 好 ， 91%-89% 为 好 ， 88%85%为可以接受，85%以下的相似度为低分 辨率的鉴别。对于只鉴定到属的鉴别，还需根 据提示信息进行补充试验，进一步甄别到种。
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五、鉴定结果
（一）人员环境总体结果 一车间：110株
其中：人员67株 环境43株
二车间：182株 其中：人员133株 环境49株
总计：292株，其中阳性球菌109株（37.3%） 阳性芽孢杆菌 114株（39.0%） 阳性无芽孢杆菌 22株（7.5%） 阴性杆菌 39株（13.4%）
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四、鉴定方法
施氏假单胞菌
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18
四、鉴定方法
2.革兰氏染色及镜检
表皮葡萄球菌
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19
四、鉴定方法
2.革兰氏染色及镜检
缓慢芽孢杆菌
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四、鉴定方法
2.革兰氏染色及镜检
施氏假单胞菌
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四、鉴定方法
3.生化鉴定 （1）采用全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第三季度：
在本季度，阳性球菌的检出率为38.3%，阴性杆菌检出率为31.7%，阳 性芽孢杆菌检出率为16.7%， 阳性无芽孢杆菌检出率为6.7%。
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第四季度：
本季度阳性球菌的检出率为35.7%，阴性杆菌的检出率为 21.4%，阳性芽孢杆菌的检出率为26.8%，阳性无芽孢杆菌
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第一季度：
本季度阳性芽孢杆菌的检出率最高，达到了44.9%；阳性球菌的检出率 居第2位为43.5%，阳性杆菌的检出率为7.2%，阴性杆菌的检出率为 4.3%。
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第二季度：
在本季度，阳性芽孢杆菌的种群占据绝对优势地位，为54.2%；阳性球 菌的检出率为33.6%；阳性无芽孢杆菌和阴性杆菌的检出率均为5.6%。
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三、试验材料及仪器设备
4．试剂试药 革兰氏染色液：青岛高科园海博生物科 技有限公司；
GN鉴定卡、GP鉴定卡、BCL鉴定卡、 YST鉴定卡、ANC鉴定卡：法国生物梅 里埃公司。
API
RP
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四、鉴定方法
鉴定流程图
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四、鉴定方法
1.菌种的纯化与复壮
采集的微生物可能在物理的、化学的消杀条件下暴露 了较长时间，菌株本身可能存在一定的损伤和变异 ，有必 要对送检菌株进行复壮和再次纯化。
2．培养基
胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA），批号： 1221965，BD公司； 麦康凯琼脂（Mac），批号：1108423, BD公司； MRS琼脂，批号：100915，北京陆桥技术有限 责任公司
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三、试验材料及仪器设备
3．仪器设备
全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2 Compact）：法国生物梅里埃公司； 麦氏浊度比浊仪：法国生物梅里埃公司； BX 41 光学成像显微镜：日本奥林巴斯公司； 卡玛薄层色谱成像仪:瑞士CAMAG卡玛公司。 API RP
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3
二、采样方案
1. 采样区域的确定 2.采样对象及方式的确定 3.采样频次的确定
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4
1. 采样区域的确定
根据车间的面积、房间数，考虑到可能影 响到产品质量的关键区域及易于受到微生 物污染的关键部位的分布，设定了监测点 及采样方案。 企业按照中国新版药品 GMP的要求，将洁净区划分为A级（动态 100级）、B级（静态100级）、C级 （10000级）、D级（100000级）。
浮游菌（A级、B级）
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3.采样频次的确定
企业根据生产情况和制剂车间的使用频次 按季度制定采样频次 ，共收集4个季度的 样本。
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9
三、试验材料及仪器设备
1．样本来源 2．培养基 3．仪器设备 4．试剂试药
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10
三、试验材料及仪器设备
1．样本来源 无菌制剂一车间和二车间286份样本
2010源自文库12
2010-12-1
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23
五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 一车间主要区域
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五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 一车间主要区域
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五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 二车间主要区域
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五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 二车间主要区域
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--无菌制剂生产过程微生物菌库的建立和种属鉴定
辽宁省食品药品检验所抗生素室 张亚杰 2012.5
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一、立项目的 二、采样方案 三、试验材料及仪器设备 四、鉴定方法 五、鉴定结果 六、结果分析 七、讨论
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一、立项目的
（1）为了了解无菌制剂生产过程中微生物污 染情况，即微生物种类及分布情况，实现生产 环境微生物、操作过程微生物与药品中污染微 生物的比较和溯源分析，以便达到生产过程微 生物实时有效动态控制目的。从而满足药品 GMP对无菌制剂生产过程中微生物污染的监测 和控制要求。 （2）生产企业也可以利用这些数据，对无菌 制剂生产过程进行微生物风险评估。
的检出率为12.5%。
微生物采样点分布图见图1和图2。其中一 车间采样点共39个，二车间采样点共98 个。
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5
1. 采样区域的确定（一车间）
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1. 采样区域的确定（二车间）
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2.采样对象及方式的确定
人员：手套印记 表面接触（头、胸、 手腕、肘、膝盖）
环境：沉降菌（ A级、B级、 C级）
首选的复壮及纯化培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基 （TSA）;对于革兰氏阴性菌，在无法与革兰氏阳性菌区分 的情况下，也会选择MaC琼脂作为纯化培养基；对于较难 培养的菌株，也采用血平板、改良MRS琼脂等进行纯培 养。
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四、鉴定方法
短小芽孢杆菌
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四、鉴定方法
溶血葡萄球菌
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Compact），根据革兰染色结果选择鉴定卡。 （2）将24小时培养物，用0.45%无菌氯化钠
溶液制备一定浊度的菌悬液，将64个生化反应 集成到Viteck鉴定卡上，一般2-10小时左右给出 鉴定结果 。
（ 3 ） 结 果 判 断 ： 相 似 度 96%-99% 为 极 好 ， 95%-92% 为 较 好 ， 91%-89% 为 好 ， 88%85%为可以接受，85%以下的相似度为低分 辨率的鉴别。对于只鉴定到属的鉴别，还需根 据提示信息进行补充试验，进一步甄别到种。
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五、鉴定结果
（一）人员环境总体结果 一车间：110株
其中：人员67株 环境43株
二车间：182株 其中：人员133株 环境49株
总计：292株，其中阳性球菌109株（37.3%） 阳性芽孢杆菌 114株（39.0%） 阳性无芽孢杆菌 22株（7.5%） 阴性杆菌 39株（13.4%）
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四、鉴定方法
施氏假单胞菌
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四、鉴定方法
2.革兰氏染色及镜检
表皮葡萄球菌
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四、鉴定方法
2.革兰氏染色及镜检
缓慢芽孢杆菌
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四、鉴定方法
2.革兰氏染色及镜检
施氏假单胞菌
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四、鉴定方法
3.生化鉴定 （1）采用全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第三季度：
在本季度，阳性球菌的检出率为38.3%，阴性杆菌检出率为31.7%，阳 性芽孢杆菌检出率为16.7%， 阳性无芽孢杆菌检出率为6.7%。
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第四季度：
本季度阳性球菌的检出率为35.7%，阴性杆菌的检出率为 21.4%，阳性芽孢杆菌的检出率为26.8%，阳性无芽孢杆菌
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第一季度：
本季度阳性芽孢杆菌的检出率最高，达到了44.9%；阳性球菌的检出率 居第2位为43.5%，阳性杆菌的检出率为7.2%，阴性杆菌的检出率为 4.3%。
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五、鉴定结果
（三）不同季节鉴定结果
第二季度：
在本季度，阳性芽孢杆菌的种群占据绝对优势地位，为54.2%；阳性球 菌的检出率为33.6%；阳性无芽孢杆菌和阴性杆菌的检出率均为5.6%。
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三、试验材料及仪器设备
4．试剂试药 革兰氏染色液：青岛高科园海博生物科 技有限公司；
GN鉴定卡、GP鉴定卡、BCL鉴定卡、 YST鉴定卡、ANC鉴定卡：法国生物梅 里埃公司。
API
RP
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四、鉴定方法
鉴定流程图
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四、鉴定方法
1.菌种的纯化与复壮
采集的微生物可能在物理的、化学的消杀条件下暴露 了较长时间，菌株本身可能存在一定的损伤和变异 ，有必 要对送检菌株进行复壮和再次纯化。
2．培养基
胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA），批号： 1221965，BD公司； 麦康凯琼脂（Mac），批号：1108423, BD公司； MRS琼脂，批号：100915，北京陆桥技术有限 责任公司
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三、试验材料及仪器设备
3．仪器设备
全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2 Compact）：法国生物梅里埃公司； 麦氏浊度比浊仪：法国生物梅里埃公司； BX 41 光学成像显微镜：日本奥林巴斯公司； 卡玛薄层色谱成像仪:瑞士CAMAG卡玛公司。 API RP
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二、采样方案
1. 采样区域的确定 2.采样对象及方式的确定 3.采样频次的确定
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1. 采样区域的确定
根据车间的面积、房间数，考虑到可能影 响到产品质量的关键区域及易于受到微生 物污染的关键部位的分布，设定了监测点 及采样方案。 企业按照中国新版药品 GMP的要求，将洁净区划分为A级（动态 100级）、B级（静态100级）、C级 （10000级）、D级（100000级）。
浮游菌（A级、B级）
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3.采样频次的确定
企业根据生产情况和制剂车间的使用频次 按季度制定采样频次 ，共收集4个季度的 样本。
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三、试验材料及仪器设备
1．样本来源 2．培养基 3．仪器设备 4．试剂试药
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三、试验材料及仪器设备
1．样本来源 无菌制剂一车间和二车间286份样本
2010源自文库12
2010-12-1
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五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 一车间主要区域
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五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 一车间主要区域
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五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 二车间主要区域
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五、鉴定结果
(二)不同区域结果— 二车间主要区域
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