微生物絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝特性

Ｑｉｕ Ｚｈｏｎｇｐｉｎ９１
１
Ｍａｏ Ｃａｎｑｕａｎ
Ｌｉｕ Ｙｕａｎｙｕｅ２
１
Ｙａｎｇ Ｌｉｚｈｏｎ９１ Ｗａｎｇ Ｙａｎｊｉｅ
Ｘｉａｏ Ｋａｉｙｏｎ９１
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００３１，Ｃｈｉｎａ；
（１）菌种的分离：取垃圾渗滤液ｌ ｍＬ，加入装有 ９９ ｍＬ生理盐水并加有玻璃珠的灭菌三角烧瓶内， 在ＱＹＣ．２００型全温振荡摇床（上海福码实验设备公 司）上，１８０ ｒ／ｍｉｎ，振荡１０ ｒａｉｎ，使其形成均匀的菌 悬液，用无菌水分别稀释至１０一、１０。和ｌＯ～，各取 ０．】ｍＬ稀释液加至含有分离培养基的平板上，３０℃ 恒温培养４８—１２０ ｈ，挑取单个菌落，反复划线分离
Ｆｉｇ．４
图４发酵液投加量的影响 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｚｙｍｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ｒａｔｅ
与菌液投加量成比例递增，在投加量为３％时絮凝 效果最佳，絮凝率为８９．８％，但投加量继续增大，絮 凝率反而降低。说明ＬＢ。所产微生物絮凝剂的最佳 用量为３％，低于或者超过这个用量絮凝效果都会 下降。这是因为在一定范围内增加絮凝剂用量，能 使胶体失去稳定状态，改变其物理化学性质，形成絮 凝体从水溶液中分离出来【１引，当絮凝剂过量时会使 所形成的絮体重新变成稳定的胶体，使得絮凝效果 反而会下降。 ２．４温度和ｐＨ对絮凝效果的影响
得到纯菌种。 （２）菌种的筛选：将分离所得到的纯菌种分别
接种到筛选培养基中．，１８０ ｒ／ｍｉｎ，３０ ｏＣ恒温振荡培 养７２ ｈ备用。于试管中加入ｐＨ为７，质量分数为 ０．４％３００目的高岭土悬浊液１０ ｍＬ，再加入０．２ ｍＬ １％的ＣａＣｌ：溶液（质量分数）和０．２ ｍＬ发酵液，振 荡使其充分混匀后静置１０ ｍｉｎ，在液面下２ ｃｍ处取 样，以不加发酵液的高岭土悬液为空白对照，测定其 上清液的ＯＤ。，测定方法同１．１。根据发酵液的絮 凝活性确定高产絮凝菌株，菌株的絮凝活性以絮凝 率（叼）表征㈡Ｊ ０。，计算公式如下：
生物工程手段实现产业化㈠引，因此，研究和开发微 生物絮凝剂具有深远的现实意义和广阔的应用 前景。
从垃圾渗滤液中筛选出一株高效微生物絮凝剂
基金项目：国家“８６３”高技术研究发展计划项目（２００６ＡＡ０６２３５３）： 四川省科技厅科技支撵计划项目（２００８ＳＺ０００８）；西南交 通大学科学研究基金资助项目（２００７８１０）
将ＬＢ．接种到筛选培养基中，每１２ ｈ测定其生 长曲线及培养液对高岭土悬浊液的絮凝活性，以确 定最佳产絮凝剂的时间以及菌体生长与产絮凝剂的 关系，结果如图ｌ所示。图１所示的生长曲线表明， ＬＢ。于１２ ｈ进入对数生长期，４８ ｈ进入稳定期，６０ ｈ 后其ＯＤ。逐渐降低，到９６ ｈ下降明显；絮凝曲线表 明，ＬＢ，经历了对数生长期至衰亡期的整个生长周 期，ＬＢ，发酵液的絮凝率均逐渐增加，直至９６ ｈ达 到最大并基本趋于稳定，为９０．６％，故其最佳产絮 凝时间为９６ ｈ。不同生长时期菌株ＬＢ，培养物的特 点见图２。０—７２ ｈ ＬＢ．的生长速度很快，培养液越 来越浑浊，见图２ａ，至９６ ｈ开始随着时间的推移， ＬＢ，菌体逐渐粘附在一起形成细菌絮体，发酵液逐 渐变得澄清透明（图２ｂ和图２ｃ），说明ＬＢ，在生长 过程中会形成多糖一蛋白质复合物及氨基酸聚合物 等粘液状物质‘”１，使ＬＢ，逐渐粘附在一起，从而导 致ＯＤ瑚随着培养时间的延长而逐渐降低。
田：掣×１００％
叼２１■ｘ
式中：Ａ。为空白对照ＯＤ。；Ａ为测定管ＯＤ，，。。 １．４细胞生长周期及产絮凝剂周期的测定
将微生物絮凝剂产生菌接种到筛选培养基中， 于３０℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ恒温振荡培养，每１２ ｈ取混匀的 菌悬液２ ｍＬ，以未接种菌种的培养基作参比调零， 测定培养液ＯＤ跏，同时测定培养液对高岭土悬浊液
ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｏｒｇａｎｉｃ
ｍａｔｔｅｒ（ＥＯＭ）ｏｆ
ＬＢ １
ｄｕｒｉｎｇ
ＬＢ ｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｐｈａｓｅ ｏｆ ＬＢ １．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉａ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍ—
分离培养基：蛋白胨１０．０ ｇ，牛肉膏３．０ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，琼脂２０ ｇ，蒸馏水ｌ ０００ ｍＬ，调节ｐＨ ７．０—７．２。
筛选培养基：葡萄糖３０ ｇ，ＮａＮＯ，２．０ ｇ，ＫＣｌ
０．５ ｇ，Ｋ２ＨＰ０４ １．０ ｇ，ＭｇＳ０４·７Ｈ２０ ０．５ ｇ，ＦｅＳ０４ ０．Ｏｌ ｇ，蒸馏水１ ０００ ｍＬ。 １．３菌种的筛选
关键词 微生物絮凝剂 絮凝活性 假单胞菌 筛选 废水处理
中图分类号Ｘ１７２
文献标识码Ａ
文章编号１６７３－９１０８（２００９）０７－１１８５－０４
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｂｉｏｆｌｏｃｃｕｌａｎｔ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
１材料与方法
１．１样品来源 含菌样品取自成都市长安垃圾填埋场的垃圾渗
滤液。生活污水取自西南交通大学家属区下水道污 水，泥浆废水、墨汁、黑色素溶液自配。配制方法为 将上述废水搅拌均匀，静置１０ ｒａｉｎ取上层液体，以 蒸馏水为空白对照，使用光程为１０ ｍｍ的比色皿， 利用７２２Ｎ型分光光度计（上海精密科学仪器公司） 在波长５５０ ｎｍ下测定，使其吸光度ＯＤ，。。在１．２５～ １．３５之间。 Ｉ．２培养基
２．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅａｒｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｎ明ｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｂｉｏｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ，ｎａｍｅｄ ＬＢ １，ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｃｈａｔｅ ｂｙ ｒｏｕ— ｔｉｎｅ ｍｉｃｒｏ—ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＬＢ ｌ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉ－ ｃａｌ—ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏ．ｆｌｏｃｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＬＢ．ｗｅｒｅ
ａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏ－ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ
ｍｉｃｒｏ．ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ
ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ
ＬＢ １
ｆｌｏｃｃｕｌａｔｅ
ｓｏｍｅ
ｋｉｎｄｓ ｏｆ
ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｅｆｆｅＣ．
ｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｐｕｔ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ—ｆｌｏｃｓ ｉｓ ３％（ｗｖ）．Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ．ｆｌｏｃｓ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｅｔ＇－
第３卷第７期 ２ ０ ０ ９年７月
环境工程学报
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖ０１．３，Ｎ。．７ Ｊｕｌ．２ ０ ０ ９
微生物絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝特性
邱忠平１ 茆灿泉１ 刘源月２ 杨立中１ 王艳捷１ 肖开勇１
（１．西南交通大学生物上程学院，成都６１００３１；２．南京大学国际地球系统科学所，南京２１００９３）
摘要采用常规的微生物学方法，从垃圾渗滤液中筛选到一株高效微生物絮凝剂产生菌ＬＢ．，根据其形态学和生理 生化特征初步鉴定该菌株属于假单胞菌属，命名为Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＬＢ。。ＬＢ，所产微生物絮凝剂的絮凝特性的研究结果表 明，ＬＢ。的最佳产絮凝时间为９６ ｈ，所产絮凝活性物质主要是其生长过程中的胞外分泌物和细胞生长后期的次级代谢产物， 菌体细胞本身具有一定的助凝作用。ＬＢ。所产絮凝剂最佳加样量为３％（体积分数ＷＶ）；对ｐＨ的适应范围较宽，在４—１０ 之间具有较高的絮凝活性，均大于７５％；温度为２５℃时絮凝率为８６．３％，在２５一印℃之间，絮凝率基本保持稳定；ＬＢ。所产 絮凝剂对几种废水具有较好的絮凝效果。
收藕日期：２００９—０１—０６；修订日期：２００９—０２—１０ 作者简介：邱忠平（１９６７一），女，高级工程师，主要从事水污染控制
与环境生物技术研究工作。Ｅ．ｍቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｉｌ：ｚｈｏｎｇｐｉｎｇｑ＠ｓｉｎ＆ｅｏｍ
万方数据
１１８６
环境工程学报
第３卷
产生菌ＬＢ。，对其进行了初步的生理生化鉴定，并对 ＬＢ，所产微生物絮凝剂的特性和实际应用进行了研 究，以期为今后该微生物絮凝剂的系统性研究工作 奠定初步的基础。
ｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｂｏｖｅ ７５％ａｔ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ４ ｔｏ １０ ｂｅｃａｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＨ ｔｈｅ ｆｌｏｃｓ ｈａｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ． Ａｔ ２５ ｏＣ，ｔｈｅ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈ ８６．３％．Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｈｅａｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｖａｒｉｅｓ ｆｒｏｍ ２５ ｔｏ ６０℃， ｔｈｅ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｄｏ ｎｏｔ ｆｌｕｃｔｕａｔｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔ；ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＬＢ １；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔ—
ｍｅｎｔ
絮凝在给水和排水中均发挥着不可缺少的重要 作用，所应用的絮凝剂主要有传统的无机、有机絮凝 剂及生物絮凝剂，前者由于具有价格低廉，絮凝效果 好等优点，因而被广泛使用，但由于其对人类健康所 形成的隐患使其应用越来越受到限制¨’２１。微生物 絮凝剂是一种由微生物产生的具有絮凝活性的高分 子化合物，具有絮凝沉降性能好、安全、无毒、无二次 污染、易于生物降解等优点，不仅能快速絮凝、沉淀 各种水中的悬浮颗粒、金属离子，而且在废水脱色、 高浓度有机物去除等方面有独特效果＂曲－，是一类 极具发展前景的环境友好型水处理剂。同时，由于 能产生絮凝作用的微生物种类多、生长快、易于采取
‘ｃ Ｊ ３００ ｈ
图２不同生长时期ＬＢ．的特点
Ｆｉｇ．２ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＬＢＩ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｉｏｄｓ
为研究ＬＢ。所产絮凝剂的活性分布，将ＬＢ， ９６ ｈ的发酵液离心，用生理盐水将ＬＢ，菌体细胞洗 涤３次，最后稀释成菌悬液，分别测定发酵液、上清 液和菌悬液对高岭土悬浊液的絮凝能力，以确定 ＬＢ。所产絮凝剂的絮凝活性分布，结果如图３所示。
的絮凝活性。
２结果与讨论
２．１菌种筛选和初步鉴定 经筛选得到的菌株ＬＢ。对高岭土悬浊液絮凝率
为８８．５％，多次传代培养后絮凝活性仍然高于 ８０％，说明具有絮凝活性的遗传稳定性，适合进行后 续研究工作。ＬＢ．的形态学特征：菌落不透明，圆 形，隆起，边缘不整齐，表面湿润、光滑、有光泽、粘状 液，为光滑型菌落；为革兰氏阴性杆菌，有荚膜和鞭 毛，无芽孢，为严格好氧菌。生理生化反应为：氧化 酶实验阳性；Ｏ／Ｆ实验为有氧氧化，产酸不产气；动 力实验为阳性；精氨酸双水解酶、苯丙氨酸、赖氨酸、 鸟氨酸均为阳性；硝酸盐、尿素和硫化氢实验阴性； 不液化明胶，不水解淀粉；能利用葡萄糖、山梨醇、侧 金盏花醇、木胶糖，产酸不产气。根据上述形态学特 征和生理生化反应，参照文献［１１，１２］，初步鉴定 ＬＢｌ属于假单胞菌属，命名为Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＬＢｌ。 ２．２ ＬＢ，的生长特性及产絮凝特性
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ—ｆｌｏｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＬＢ ｉｓ ９６ ｈｏｕｒｓ；ａｎｄ
ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｆｏｕｎｄ
ｉｎ
ｔｈｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｌｉｑｕｏｒ，ｃｏｍｐｒｉｓｅ
图１ ＬＢ，生长曲线与絮凝率
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ａｎｄ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ｒａｔｅ
万方数据
第７期
邱忠平等：微生物絮凝剂产生菌的筛选及其絮凝特性
１１８７
１００ ８０
孓６０ ￥４０
２０
０
加样量体积分数（％）
【ａＪ ４８ ｈ
【ｂＪ １４４ ｈ