微生物次生代谢产物研究方法
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弊端：不能保证有活性的化合物一定为新化合物，有一定风险；有可能 会漏掉在该筛选模型中无活性，但有可能具有其他潜在生物活性 的新化合物；活性跟踪有时受限于“协同效应”；不方便同时跟
踪
系统分离
对于经过或未经过生物活性筛选的提取物，在分离纯化过程中不 经筛选模型的跟踪指导，分离纯化所有能够得到的纯化合物，并解析 结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点，参考相关文 献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。偏重于传统的 天然产物化学研究方法，比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性 的研究。
活性引导的分离
对于显示有特定生物活性的粗提物，在分离纯化过程中每一步都用
该筛选模型跟踪分离有活性的组分，直至分离得到具有活性的纯化合物。 特别适用于主要对活性成分感兴趣的研究。
优点：是天然产物化学研究的一个重要的新趋势； 能集中精力，有目的性的分离想要得到的活性物质； 分离和结构解析的工作量相对都较小； 有清晰的研究思路，对于文章写作有一定好处。
目的 固液分离
固相（滤渣）：菌体及悬浊物等 水相：胞外次生代谢产物（与部分水溶性大分子）
浓缩富集
原则 1) 时间短； 2) 温度低； 3) pH适中（比较稳妥）； 4) 生物安全（不可忽视）
前处理的一般流程
发酵液
预处理
加热（使蛋白质等大分子变性沉淀，慎用/预试验） 调pH（同上，慎用/预试验） 絮凝（使菌体、悬浮物、大分子、粘稠物等沉淀或吸附聚集，有助 滤作用，对于细菌、放线菌、微藻很适用，明矾、硅藻土、纤维素等）
抽滤，过滤，板框式压滤机 固液分离
微滤截菌及 悬浮杂物
水相
滤渣（菌体及杂物）
超滤除蛋 白、多糖 等大分子
反渗透除 盐、单糖 、氨基酸 等过小分 子并除水 浓缩
效率很高 的新思路
经减压浓缩 或不浓缩
吸附富集/ 固相萃取
大孔吸附树 脂、活性炭 、亲和柱等
溶剂萃取
甲醇、丙酮、 氯仿－甲醇等
有机溶剂 萃取（按 极性递增 的顺序）
胞 外 产 物
用水、醇的 水溶液、丙酮
等梯度洗脱
比较/合并？
胞内产物
通用性好，可 按极性实现初 步分段，条件 简易；但费时 、易喷溅、有 机溶剂用量大、 乳化现象严重
大大减少工作量， 且可按分子量、极 性等实现较好的 初步分离，但通用 性不及溶剂萃取法
也可索氏提取
二、分离与纯化
两种分离纯化策略
活性引导的分离 系统分离
影响化合物极性的因素：
(1) 化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳 数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。
(2) 取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况 下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。
1.2发酵液的前处理
1.2.1 发酵液的复杂组成/特点
含水多，产物含量低； 含菌体及水溶性蛋白； 溶有原来培养基成分； 相当多的副产物和色素； 易被杂菌污染或产物可能会分解； 易起泡，悬浊物及粘性物质（多糖）多。
目标产物
胞内产物（菌体） 胞外产物（发酵液/水相）
1.2.2前处理目的、原则与流程
(2) 摇瓶培养（实验室规模） 适用：细菌、放线菌、真菌 （厌氧菌不太适宜摇瓶培养，密封 瓶一般体积、重量过大） 优点：传质好、溶氧充分，从而生长迅 速、周期短 缺点：要进行大规模发酵需要大量摇床， 占用空间大。
(3) 发酵罐培养 通气发酵罐（好氧细菌、放线菌、真菌） 厌氧发酵罐（如啤酒、有机酸、酒精的发 酵生产，次生代谢研究？） 光生物反应器（光合细菌、微藻）
避光 防氧化
旋转蒸发；有些样品需氮气保护
溶剂尽量不破坏天然成分
丙酮（与二醇反应成缩酮）；乙酸乙酯（成酯）；氯仿（酸性）
2.1 传统的分离方法源自文库
(1)萃取/溶剂分配法
相似相溶原理
极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性 溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。（一条基本原则）
如单糖、寡糖、糖苷易溶于水或醇，酚类化合物易溶于甲醇，长链脂类 化合物易溶于石油醚、氯仿
第一讲 发酵、前处理与传统分离方法
一、发酵培养与提取
培养基：碳源/能源、氮源、生长因子、无机盐、水
生长曲线及其与次生代谢关系
迟滞期、指数期、稳定期、衰亡期
种子对发酵的影响
1.1微生物大规模发酵培养的方式
(1) 液体静置培养（实验室规模） 适用：丝状真菌（三角烧瓶，好氧） 厌氧细菌（密封瓶） 优点：经济，无需专门设备 缺点：生长相对缓慢
优点：不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物， 有利于专利申请、文章撰写， 也能兼顾各种生物活性。
弊端：目的性不明确/有一定盲目性； 分离纯化与结构解析的工作量巨大； 波谱测试费用比较大
两种方法相结合，以活性引导为主线，兼顾系统分离
基本原则
尽量快速 低温
旋转蒸发（一般低于50摄氏度）；冷冻干燥；样品低温保存
优点：传质效率高、溶氧充分（好氧菌）、 温度、pH等参数可控，生长迅速， 培养量大
缺点：昂贵
(4) 固态发酵 适用：丝状真菌与酵母（如醋、酒酿造， 豆豉生产等，酶制剂、维生素、生 物毒素、抗生素），现在细菌上也 有应用 优点：供氧充分，散热及时，条件粗放、 成本低，下游处理方便 缺点：过程控制、大型化等方面有待改进
常用溶剂极性(介电常数) 甲酰胺(109)＞水(80)＞甲酸(58)＞乙腈(36.3)＞甲醇
(33)＞乙醇(24.3)＞丙酮(20.7)＞正丁醇(17.8)＞乙酸乙 酯(6.02)＞乙醚()＞氯仿(5.2)＞二氯甲烷()＞甲苯＞苯 (2.3)＞二氯乙烷()＞四氯化碳(2.24)＞二硫化碳()＞环 己烷()＞正己烷(2.0)≈石油醚()。
微生物次生代谢产物 的下游研究方法
张翼
基本流程
菌种
发酵培养
菌体 发酵液
前处理、富集提取
粗提物
分离纯化
传统方法 色谱方法
活性引导分离 或系统分离
单体化合物
结构鉴定
波谱学手段 单晶衍射 化学反应
活性 评价、 构效 关系
课程安排
第一讲：发酵、前处理与传统分离方法 第二讲：色谱学原理与实际应用（1） 第三讲：色谱学原理与实际应用（2） 第四讲：波谱分析概论及紫外、红外、质谱 第五讲：一维与二维核磁共振谱 第六讲：核磁共振谱解析实例 第七讲：其他结构鉴定常用（波谱）方法 第八讲：化合物波谱综合解析实例
踪
系统分离
对于经过或未经过生物活性筛选的提取物，在分离纯化过程中不 经筛选模型的跟踪指导，分离纯化所有能够得到的纯化合物，并解析 结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点，参考相关文 献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。偏重于传统的 天然产物化学研究方法，比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性 的研究。
活性引导的分离
对于显示有特定生物活性的粗提物，在分离纯化过程中每一步都用
该筛选模型跟踪分离有活性的组分，直至分离得到具有活性的纯化合物。 特别适用于主要对活性成分感兴趣的研究。
优点：是天然产物化学研究的一个重要的新趋势； 能集中精力，有目的性的分离想要得到的活性物质； 分离和结构解析的工作量相对都较小； 有清晰的研究思路，对于文章写作有一定好处。
目的 固液分离
固相（滤渣）：菌体及悬浊物等 水相：胞外次生代谢产物（与部分水溶性大分子）
浓缩富集
原则 1) 时间短； 2) 温度低； 3) pH适中（比较稳妥）； 4) 生物安全（不可忽视）
前处理的一般流程
发酵液
预处理
加热（使蛋白质等大分子变性沉淀，慎用/预试验） 调pH（同上，慎用/预试验） 絮凝（使菌体、悬浮物、大分子、粘稠物等沉淀或吸附聚集，有助 滤作用，对于细菌、放线菌、微藻很适用，明矾、硅藻土、纤维素等）
抽滤，过滤，板框式压滤机 固液分离
微滤截菌及 悬浮杂物
水相
滤渣（菌体及杂物）
超滤除蛋 白、多糖 等大分子
反渗透除 盐、单糖 、氨基酸 等过小分 子并除水 浓缩
效率很高 的新思路
经减压浓缩 或不浓缩
吸附富集/ 固相萃取
大孔吸附树 脂、活性炭 、亲和柱等
溶剂萃取
甲醇、丙酮、 氯仿－甲醇等
有机溶剂 萃取（按 极性递增 的顺序）
胞 外 产 物
用水、醇的 水溶液、丙酮
等梯度洗脱
比较/合并？
胞内产物
通用性好，可 按极性实现初 步分段，条件 简易；但费时 、易喷溅、有 机溶剂用量大、 乳化现象严重
大大减少工作量， 且可按分子量、极 性等实现较好的 初步分离，但通用 性不及溶剂萃取法
也可索氏提取
二、分离与纯化
两种分离纯化策略
活性引导的分离 系统分离
影响化合物极性的因素：
(1) 化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳 数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。
(2) 取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况 下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。
1.2发酵液的前处理
1.2.1 发酵液的复杂组成/特点
含水多，产物含量低； 含菌体及水溶性蛋白； 溶有原来培养基成分； 相当多的副产物和色素； 易被杂菌污染或产物可能会分解； 易起泡，悬浊物及粘性物质（多糖）多。
目标产物
胞内产物（菌体） 胞外产物（发酵液/水相）
1.2.2前处理目的、原则与流程
(2) 摇瓶培养（实验室规模） 适用：细菌、放线菌、真菌 （厌氧菌不太适宜摇瓶培养，密封 瓶一般体积、重量过大） 优点：传质好、溶氧充分，从而生长迅 速、周期短 缺点：要进行大规模发酵需要大量摇床， 占用空间大。
(3) 发酵罐培养 通气发酵罐（好氧细菌、放线菌、真菌） 厌氧发酵罐（如啤酒、有机酸、酒精的发 酵生产，次生代谢研究？） 光生物反应器（光合细菌、微藻）
避光 防氧化
旋转蒸发；有些样品需氮气保护
溶剂尽量不破坏天然成分
丙酮（与二醇反应成缩酮）；乙酸乙酯（成酯）；氯仿（酸性）
2.1 传统的分离方法源自文库
(1)萃取/溶剂分配法
相似相溶原理
极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性 溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。（一条基本原则）
如单糖、寡糖、糖苷易溶于水或醇，酚类化合物易溶于甲醇，长链脂类 化合物易溶于石油醚、氯仿
第一讲 发酵、前处理与传统分离方法
一、发酵培养与提取
培养基：碳源/能源、氮源、生长因子、无机盐、水
生长曲线及其与次生代谢关系
迟滞期、指数期、稳定期、衰亡期
种子对发酵的影响
1.1微生物大规模发酵培养的方式
(1) 液体静置培养（实验室规模） 适用：丝状真菌（三角烧瓶，好氧） 厌氧细菌（密封瓶） 优点：经济，无需专门设备 缺点：生长相对缓慢
优点：不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物， 有利于专利申请、文章撰写， 也能兼顾各种生物活性。
弊端：目的性不明确/有一定盲目性； 分离纯化与结构解析的工作量巨大； 波谱测试费用比较大
两种方法相结合，以活性引导为主线，兼顾系统分离
基本原则
尽量快速 低温
旋转蒸发（一般低于50摄氏度）；冷冻干燥；样品低温保存
优点：传质效率高、溶氧充分（好氧菌）、 温度、pH等参数可控，生长迅速， 培养量大
缺点：昂贵
(4) 固态发酵 适用：丝状真菌与酵母（如醋、酒酿造， 豆豉生产等，酶制剂、维生素、生 物毒素、抗生素），现在细菌上也 有应用 优点：供氧充分，散热及时，条件粗放、 成本低，下游处理方便 缺点：过程控制、大型化等方面有待改进
常用溶剂极性(介电常数) 甲酰胺(109)＞水(80)＞甲酸(58)＞乙腈(36.3)＞甲醇
(33)＞乙醇(24.3)＞丙酮(20.7)＞正丁醇(17.8)＞乙酸乙 酯(6.02)＞乙醚()＞氯仿(5.2)＞二氯甲烷()＞甲苯＞苯 (2.3)＞二氯乙烷()＞四氯化碳(2.24)＞二硫化碳()＞环 己烷()＞正己烷(2.0)≈石油醚()。
微生物次生代谢产物 的下游研究方法
张翼
基本流程
菌种
发酵培养
菌体 发酵液
前处理、富集提取
粗提物
分离纯化
传统方法 色谱方法
活性引导分离 或系统分离
单体化合物
结构鉴定
波谱学手段 单晶衍射 化学反应
活性 评价、 构效 关系
课程安排
第一讲：发酵、前处理与传统分离方法 第二讲：色谱学原理与实际应用（1） 第三讲：色谱学原理与实际应用（2） 第四讲：波谱分析概论及紫外、红外、质谱 第五讲：一维与二维核磁共振谱 第六讲：核磁共振谱解析实例 第七讲：其他结构鉴定常用（波谱）方法 第八讲：化合物波谱综合解析实例