第六章-工业微生物育种

（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
初筛 2步 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的 相关性
（2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素
透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初 筛指标）
物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。
( NTG——超诱变剂）
UV是最常用的一种诱变剂
2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂 3、参考出发菌株原有的诱变谱系来选择诱变剂
4. 剂量的选择
常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲 线） 最适剂量：既能扩大变异幅度，又能使变异向 正突变范围移动的剂量。(P103) 突变率随剂量的增加而提高，达一定程度后， 再提高剂量, 反而会使突变率下降。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现 在偏高剂量中。 常采用相对杀菌率为70-75%。
大家好
第六章 工业微生物 诱变育种
诱变育种
是指利用物理或化学诱变剂处理均 匀分散的微生物细胞群，在促进其 突变频率显著提高的基础上，从中 挑选少数符合目的的突变株，以供 科学实验或生产实践使用。
从青霉素产量看诱变育种
时间
1943 1943 1943 1945 1947 1955 1971 1977 目前
二、诱变育种的基本原则
• 选择简便有效的诱变剂； • 挑选优良的出发菌株； • 处理单细胞或单孢子悬液； • 选用最适的诱变剂量； • 充分利用复合处理的协同效应； • 利用和创造形态、生理与产量间的相关 指标； • 设计高效筛选方案； • 创造新型筛选方法。
三、几种重要突变株的筛选方法
1. 抗性突变株的筛选
一、诱变育种的实验准备
（一）诱变前对出发菌株的了解 1、区分不同菌落类型 2、出现不同菌落类型原因
出发菌株
（二）全面了解菌种特性和生产性能的关系 （三）了解影响菌种生长发育的主要因素 1、培养基 2、斜面培养基的制备技术 3、接种量 4、温度 5、湿度 6、药品和原材料质量
（四）了解菌种有效产物中的各种组分 在代谢合成过程中与培养条件的关系
（五）建立一个准确、简便、快速检测 产物的方法
（六）研究最佳的菌种保藏培养基和培 养条件
二、诱变育种的步骤及方法
（一）选择合适的出发菌株 1、对一般菌株的要求 野生菌株对诱变剂敏感 最好选用来自生产中的自发突变菌株。 具有有利性状（如高产、生长速度快、营
养要求粗放、标记明显等）； 可选用已发生过其他突变的菌株。
2、选择具有一定生产能力或某种特性的菌株 作为出发菌株
3、选择纯种做出发菌株 4、选择出发菌株应考虑其稳定性 5、连续诱变育种过程中如何选择出发菌株 6、采用多出发菌株 7、了解菌种代谢特点
（三）制备待处理的菌悬液
1、选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散） 目的：①使每个细胞能均匀接触诱变剂；
②减少表型延迟现象（诱变后性状的分离 及退化现象） 同步培养（生理状态一致） 菌龄：对诱变剂最敏感时期
（2）抗药性突变株 用途：筛选相应药物(抗生素) 的高产菌株
或遗传标记制作 筛选的方法:
效应的影响 3）菌落密度效应
（四） 中间培养（CM，培养过夜）
目的：克服表型延迟 表生纯型理合延性状迟延态（迟p时h的en,o原由ty因p于ic:l杂ag当）合：变期表现异所型象细的.合改胞成变由的落杂后非于合变基状异因态型的改变蛋变为白的 或酶分离仍性然延发迟：挥突作变用的,基必因须经经DN过A复细制胞和细多胞代分分裂后离变后成,纯才 能将这些非变合异状的态酶，表稀型释才掉能表,最现终出来达。到变异后应 该 。分出表离生现理性现双性延的核延迟形迟现的：态象原表由,，如因现杂多:营出合来状核养对。态细缺数变胞陷为生纯的型长合核突期状也变态中，成株，突倍的单变增筛核表型加选细仍，过胞不诱程常能 变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上 ，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几 代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推 迟现象称为分离延迟现象。
发酵单位(u/ml)
100
250 500 ～ 850 ～ 850 ～8000 ～ 2万 ～ 5万 5～10万
效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位
诱变育种目的
• 提高有效产物的产量 • 改变菌种特性，提高产品质量 • 简化工艺条件 • 开发新品种
诱变育种的过程
选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验
（五） 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用； ④紫外线光复活交替处理 ⑤诱变剂处理时间与诱变效应的关系
（六）影响突变率的因素 1、菌种遗传特性不同 2、菌体细胞壁结构不同 3、环境条件的影响 1）诱变前预培养 2）温度、pH、氧气等外界条件对诱变
（3）浓度梯度法 （4）影印平板法 （5）琼脂块大通量筛选方法
• 2. 复筛（以质为主，定量测定） （1）摇瓶培养，直接检测所需产物 （2）产物活性检查 琼脂平板活性圈法 纸片法 琼脂薄层纸片法 （3）复筛数据的调整 菌落、菌体形态观察进一步筛选突变株； 培养基和条件的调整； 菌株纯度及遗传特性进行研究
(1) 抗终代谢物结构类似物突变株的筛选 用途：筛选相应代谢物的高产菌株
结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上 和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的 物质。 如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物 ，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株， 可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。
营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期
菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制
菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL
不产孢子真菌：采用幼龄菌丝，三源自文库方法制。 制备原生质体作为诱变材料。
（四）诱变剂的选择及处理方法
1. 诱变剂的选择（高效，简便）